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蛋白常见问题及解答

发布时间: 2024-01-23  点击次数: 186次

Q: 什么是蛋白表达和纯化?

蛋白表达是一种生物技术过程,用于产生特定的蛋白质。它可以在原核生物、真核生物或体外大肠杆菌表达系统中进行。蛋白纯化是一系列旨在从细胞或生物体中分离出一个或几个蛋白质的过程。蛋白质纯化的经常用方法是亲和层析,它通过不同的蛋白质标签进行设计。其他蛋白质纯化方法包括离子交换层析、分子排阻层析、抛光纯化和疏水相互作用层析,可用于处理高纯度的无标签蛋白质。

Q: 蛋白质是如何纯化的?纯度是否有保证?

根据融合蛋白的标签类型和蛋白质本身的理化特性设计最佳纯化方案。常用的纯化方法包括:亲和层析、疏水层析、离子交换层析、分子筛、盐析等。我们保证的特别低纯度标准为>85%。如果初始纯化未达到此标准或客户有更高的纯度要求,我们还拥有AKATA纯化仪器,该仪器高度自动化、精确控制,结合使用各种柱子,确保我们的蛋白质产品的纯度进一步提高,并在COA报告上显示最终纯度测试结果。

虽然我们保证的特别低纯度标准为>85%,但我们制备的一些蛋白质的纯度达到了95%甚至97%。

Q: 为什么没有或蛋白表达量很低?

可能存在的原因有:

a. 向量构建错误。您应该通过测序确认向量或申请CUSABIO定制克隆服务。

b. 稀有密码子。你应该优化密码子,使用补充稀有密码子的菌株,在较低的温度下诱导或在较差的培养基中生长

c. 蛋白质毒性。您应该使用调控更严格的启动子或较低的质粒拷贝数。在基于T7系统的菌株中使用pLysS/pLysE菌株,或者选择更适合表达毒性蛋白质的菌株。在高OD值下开始诱导并缩短诱导时间。在使用含有Lac启动子的表达载体时添加葡萄糖。

Q: 如何表达具有生物活性的蛋白质?为什么蛋白质无活性?

为了获得具有生物活性的蛋白质,您应选择正确的表达系统、适当地表达载体、合适的纯化方法以及验证实验。此外,您还可以检查以下问题:

a. 蛋白质的溶解度较低。您可以将所需的蛋白质与融合伴侣融合,并降低温度。

b. 缺乏必要的翻译后修饰。您应选择另一个表达系统。

c. 折叠不完整。您应使用融合伴侣,并使用具有冷适应分子伴侣的菌株。在较低温度下与分子伴侣共同表达。监测二硫键的形成,并允许进一步的体外折叠。

d. cDNA中的突变。您应在诱导前后测序质粒,或使用recA-菌株确保质粒的稳定性。在每次表达循环前转化大肠杆菌。

Q: 如何避免包涵体的形成并改善可溶性表达?

a. 高亲水性或跨膜结构的蛋白质。您应该添加融合标签或加入热休克分子伴侣。在低温下较短时间诱导表达,或者转换至贫负载培养基。产生截短形式的蛋白质或使用富含膜的菌株。

b. 错误的二硫键形成。您应该添加融合伴侣蛋白,包括巯基还原酶、DsbA和DsbC。克隆到含有分泌信号肽的质粒中,使其分泌到细胞外腔。使用具有氧化型胞质环境的gamiB (DE3)菌株。降低诱导剂浓度和诱导温度。

c. 错误的折叠。您应该使用融合伴侣蛋白。与分子伴侣一同共表达。使用具有冷适应分子伴侣的菌株。向培养基中添加化学分子伴侣和辅因子。降低诱导剂浓度并添加新鲜培养基。在低温下较短时间诱导表达。

Q: 为什么蛋白质的分子量小于预测值?

可能存在的原因有:

a. 蛋白质序列中包含罕见的氨基酸硒蛋白质(Sec)或吡咯赖氨酸(Pyl)。您应该使用其他氨基酸来代替这两种不常见的氨基酸。

b. 融合蛋白质的翻译过程不平衡。您应该更换其他的融合标签或将融合标签移到C端。在低温下较短时间诱导表达,或者转换至贫负载培养基。

c. 蛋白质降解。您应该替换特定的蛋白酶位点。使用蛋白酶缺陷菌株。在高光密度下诱导表达。在低温下较短时间诱导表达,或者在破碎细胞时使用蛋白酶抑制剂。

Q: 为什么实际的带状大小与预测值不同?

可能存在的原因有:

a. 翻译后修饰。如磷酸化、糖基化等会增加蛋白质的大小。

b. 翻译后剪切。许多蛋白质首先合成为前蛋白质,然后通过剪切产生活性形式。

c. 剪接变体。剪接变异可能从同一基因产生不同大小的蛋白质。

d. 相对电荷。氨基酸的组成具有不同的相对电荷,这会影响电泳迁移性。

e. 多聚体,例如蛋白质的二聚化。通常在还原条件下会被阻止,尽管强烈的相互作用可能会导致出现较高的带状。

f. 蛋白质结构,如二硫键、蛋白质二级结构或蛋白质三维结构形成。

g. 疏水性蛋白质,如跨膜蛋白质,可能难以迁移到凝胶中,从而导致不同的多带图案。

Q: 如何重溶和储存产品?

在打开盖子之前,请先离心试剂管。

对于短期储存或使用,请使用无菌去离子水将蛋白质全部重溶至0.1-1.0 mg/mL。如有需要,重溶后经过10—15分钟后进行分装,并储存在4℃。

对于长期储存,建议将细胞因子或重组蛋白添加5%-50%的甘油(最终浓度),并进行分装以长期储存在-20℃/-80℃。我们默认的甘油最终浓度为50%。客户可以参考此浓度。

Q: CUSABIO使用哪些类型的标签进行融合?

CUSABIO提供的常见标签包括His-tag、FLAG-tag、GST-tag、MBP-tag、组合标签(His-GST-tag、His-sumo-tag、His-MBP-tag)等。有时,在制造过程中会确定蛋白质的标签类型。如果您有自己定的标签类型,请随时与我们咨询。

Q: 给定的标签类型会对蛋白质的生物活性产生什么影响?

从理论上讲,小的标签对蛋白质活性影响很小。然而,具体对蛋白质活性的影响无法一概而论(有些蛋白质没有影响,有些蛋白质有轻微影响,而有些蛋白质可能有较大影响)。

Q: CUSABIO能去除内毒素吗?

并非所有的内毒素都可以去除。如果您需要去除内毒素,请提前与我们沟通,该过程需要2~3个工作日。我们可以提供免费的内毒素去除服务,使用PMB亲和层析法,并使用LAL试剂进行半定量检测,确保内毒素水平在0.1 ng/μg(1 EU/μg)以内。

Q: CUSABIO能提供无菌生产加工吗?

是的,我们可以提供这项服务,而且是免费的,但您需要在下订单时备注此信息。我们在冻干之前对液体蛋白进行了无菌处理,但在冻干过程中可能存在污染,因此无法保证整个过程是无菌的。

Q: 如何确定细胞因子的物种交叉反应性?

a. 除了少数例外情况外,大多数人类细胞因子在小鼠细胞上具有活性。

b. 许多小鼠细胞因子也可能对人类细胞产生影响,但其活性可能低于相应的人类细胞因子。

c. 少数人类细胞因子在作用于小鼠细胞时会比相应的小鼠细胞因子更活跃,例如IL-7。

d. 干扰素、GM-CSF、IL-3和IL-4等细胞因子是物种特异性的,几乎对非同源细胞没有活性。

e. 相比之下,成纤维细胞生长因子(FGF)和神经营养因子在不同物种的细胞上都具有良好的活性,它们高度保守。

Q: 通常使用的防腐剂是什么?通常添加哪种防腐剂?

常用的防腐剂包括Proclin 300、偶氮甲烷等。我们的蛋白质产品中不添加任何防腐剂。

Q: 蛋白为什么要冻干?冻干对蛋白的影响有哪些?

蛋白质对热敏感,冻干能使绝大部分蛋白质的活性保留下来,提高蛋白的稳定性并延长保存时间,同时降低运费。

冻干有可能会造成蛋白的活性部分损失,聚集和其它变性问题。但可以通过添加保护剂(稳定剂,添加剂,辅料)和控制冻干的各种条件来尽可能降低这些负面的影响。

温馨提示:武汉华美提供的蛋白产品一般为冻干粉,它们在室温条件下非常稳定(至少1个月)。尽管如此,我们还是建议您在收到我们的产品后保存于-20℃ ,以确保蛋白100%的活性。

Q: 冻干前为什么向蛋白溶液中加保护剂?一般冻干保护剂有哪几种?你们的产品通常加的保护剂是什么?

保护剂是用来在冻干和储存过程中保护蛋白的。常用的保护剂或稳定剂有糖类,多元醇,聚合物,表面活性剂,某些蛋白和氨基酸等。我们通常加8%(质量比体积)的海藻糖和甘露醇作为冻干保护剂。海藻糖可明显阻止蛋白质二级结构改变以及冻干过程中蛋白质的伸展和聚集;甘露醇也是一种普遍应用的冻干保护剂和填充剂,可以降低某些蛋白的冻干后聚集情况。

温馨提示:对于大多数蛋白,重悬后在4℃仅能短期保存(约1周)。如想长期保存,请先配制成稀释液(其中必须含有载体蛋白,如0.1% BSA,5%HSA,或10% FBS),然后分装冻存于-20℃或-80℃。一定要避免反复冻融,因每次冻融均会引起蛋白的部分失活。

Q: 为什么我的管内几乎看不见蛋白产品?

CUSABIO的蛋白产品中不含载体蛋白或其它添加物(如牛血清白蛋白(BSA),人血清白蛋白(HSA)和蔗糖等,并以特别低含盐量的溶液进行冻干时,常常不能形成白色网架结构,而是微量的蛋白在冻干过程中沉积在管内,形成很薄或肉眼不可见的透明蛋白层。

温馨提示:在打开管盖前,我们建议您在小离心机中快速离心20-30秒,使附着在管盖或管壁上的蛋白聚集于管底。我们的质控步骤保证每管中所含的蛋白量准确无误,虽然有时您无法看到蛋白粉末,但管中的蛋白含量仍是非常精确的。

Q: 应如何确定细胞因子的种属交叉活性?

1) 除少数例外,大多数人类细胞因子对小鼠细胞均有活性。2) 许多小鼠细胞因子也可作用于人类细胞,但比活性可能低于对应的人类细胞因子。 3) IL-7等为数不多的人类细胞因子作用于小鼠细胞时比对应的小鼠细胞因子活性更强。4) 干扰素,GM-CSF, IL-3和IL-4等细胞因子种属特异,对非同源细胞几乎没有活性。5) 相反,成纤维细胞生长因子(FGFs)和神经营养素(neurotrophins)高度保守,在不同动物种属细胞上均具有很好的活性。

Q: 应如何正确溶解重组蛋白产品?

第1步:开盖前离心试剂管。冻干粉在运输过程中可能会因颠簸而漂散并粘贴于管壁或管盖上,所以在打开塑料瓶盖前,需将冻干粉通过离心收集到管底,以便用很小体积的液体即可将冻干粉全部溶解。一般需要3000-3500rpm离心5min,效果良好。


第2步:用无菌水重悬至0.1-1.0 mg/ml,不可振荡。这个步骤即为溶解步骤,非常重要。

1) 一定要用推荐的溶液重悬(或溶解)冻干粉。蛋白的溶解性与很多因素有关,其中比较重要的是pH值和离子强度。产品说明上所标明的溶解液是能够将该细胞因子或重组蛋白全部溶解的液体。如果您所用的溶解液的pH值和离子强度与说明书中所标明的不符,很多时候会造成细胞因子或重组蛋白不能全部溶解或者根本无法溶解,这样所配得的细胞因子或重组蛋白必然活性不够或丧失。

2) 一定要溶解到自己定的浓度。蛋白在一定的浓度范围内可以保持良好的稳定性,这个范围就是说明书上所标明的浓度范围,一般为0.1-1.0 mg/ml。但这一浓度范围对于不同的重组蛋白是不同的。高于或低于该浓度范围时细胞因子或蛋白会不稳定,即很容易出现活性下降的现象。其次,高于这个浓度范围,可能会超过该蛋白的最大溶解浓度,即蛋白无法全部溶解。再者,高于或低于该浓度范围,蛋白可能会出现聚集(aggregation),最终结果还是部分蛋白未溶解,导致蛋白活性的减弱。

3) 一定不能振荡(vortex)。这里所说的振荡是指用涡旋仪进行快速振荡。请用放至室温的缓冲液作为溶剂。加缓冲液后,盖好瓶塞,轻轻用手翻转瓶子或把瓶子放在一个缓慢摇摆的摇床上。这样做来保证缓冲液能够接触到瓶子的整个内壁。 让瓶子在室温放置至少10 - 15分钟,然后可以进行分装或使用。


第3步:该重悬液在2-8℃最长可保存1周。

用说明书上推荐的溶液将细胞因子或重组蛋白重悬到推荐的浓度后,细胞因子或重组蛋白可放置在2-8℃,即冰箱的冷藏室。在这种条件下,细胞因子或重组蛋白的活性最长可保持1周。这对一个周期为5-7天的实验,如DC(树突状细胞)的诱导成熟是足够的。在此期间,只要每次从冰箱里吸取一定量的细胞因子或重组蛋白溶液加入到培养体系内即可。

其实,说明书上推荐的浓度对于一般的实验来讲是比较高的。所以用户通常会将该溶液进一步稀释后再放在4℃保存,待1周内用完。如进行稀释,必须遵照下面第4步的方法,即需用含载体蛋白的溶液进行稀释,否则稀释后的细胞因子或重组蛋白很容易会粘附在管壁或瓶壁上,使得溶液中的细胞因子或重组蛋白的浓度下降,细胞因子或重组蛋白的总活性则大为减弱。


第4步:如要长期保存,则需用含载体蛋白(如0.1% BSA,或10% FBS,或5% HSA)的溶液进一步稀释,然后分装冻存于-20℃至-80℃。

如果一个实验周期长于一周,或配制的细胞因子或重组蛋白一次用不完,我们就需对细胞因子或重组蛋白进行长期保存。方法是:将已重悬的细胞因子或蛋白用含载体蛋白,如0.1% BSA(牛血清白蛋白),10% FBS(胎牛血清),5% HSA(人血清白蛋白)的溶液将重悬液进一步稀释,然后分装冻存于-20℃至-80℃,即常规冰箱的冷冻室或超低温冰箱中。

在分装冻存前,一定要用含载体蛋白的溶液将重悬液进一步稀释。稀释后的细胞因子或重组蛋白可为任意浓度,因大量的载体蛋白可以保证低浓度细胞因子或重组蛋白仍然维持较高的稳定性。

即在做无血清培养或动物的体内实验时,细胞因子中不能含有BSA,FBS或HSA等动物或人的蛋白,要想长期保存细胞因子或重组蛋白则可用海藻糖(Trehalose)作为载体,用含海藻糖的溶液来稀释已重悬的细胞因子或重组蛋白,然后分装冻存。

 

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