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抗体常见问题及解答

发布时间: 2024-01-23  点击次数: 62次

Q: 什么是特定的抗体?

抗体(Ab),也被称为免疫球蛋白(Ig),是一种Y型的蛋白质,通过Fab区域的可变区域来中和病原体,例如致病性细菌和病毒。

Q: 如何选择适合我的实验的正确抗体?CUSABIO是否提供具有多种应用的抗体?

您在选择抗体时需要注意以下几个方面:样本的物种、抗体的宿主物种、抗体的标记方式以及适用于您实验的推荐稀释比例。CUSABIO保证其抗体适用于标注在网站或产品数据表上的应用和物种。如果您使用的应用我们没有测试过,我们将为您提供试用样品,在购买正装之前进行评估。

Q: 单克隆抗体和多克隆抗体有什么区别?

单克隆抗体是使用相同的克隆免疫细胞制备而成,它们都是来自一个特定的母细胞的克隆。因此,它们对同一抗原和表位具有亲和力。多克隆抗体是使用多个不同的免疫细胞制备而成,它们对同一抗原具有亲和力,但结合的表位不同。单克隆抗体只结合一个表位,而多克隆抗体则结合同一蛋白质上的不同表位。单克隆抗体比多克隆抗体更加特异且背景噪音更少,因此在生化分析中通常更可取。然而,单克隆抗体的生产成本通常更高,适应性较差,并且对抗原的微小变化非常敏感。

Q: 一抗和二抗之间有什么关系?如何选择适合我实验的正确二抗?

一般情况下,一抗用于捕获目标蛋白,二抗能够与一抗结合,并且标记有可以放大检测信号的酶或染料。我们建议您考虑以下几个因素:

a. 根据宿主物种选择。例如,如果一抗来自小鼠,那么二抗应该是抗小鼠的。

b. 根据一抗的特性选择。

c. 根据您的实验应用,例如WB、IHC、ELISA等。

Q: 您能告诉我每个抗体结合多少个生物素吗?

生物素与抗体的摩尔比为36.6:1。然而,很难准确说出每个抗体结合了多少个生物素,因为标记是通过赖氨酸残基进行的,并不清楚有多少个原始氨基团与生物素结合。平均而言,每个IgG分子可以结合3—5个生物素分子。

Q: 为什么实际带状物的分子量大于理论分子量?

您可以使用CUSABIO的分子量计算器计算抗体的分子量。如果测试结果与理论分子量之间有很大差异,可能的原因包括:目标蛋白存在多个修饰位点,例如糖基化,或者与其他蛋白质形成稳定的复合物,或者被切割或降解。

Q:为什么我收到的抗体容量少于标签上所标示的容量?

在运输和储存过程中,少量的抗体可能会附着在产品瓶盖的密封处。如果需要,可以在台式离心机上对瓶子进行短暂离心,以使容器盖中的液体脱离。

Q: 您能为该抗体推荐同型对照吗?

同型对照用于确认一抗结合的特异性,以排除非特异性Fc受体结合或其他蛋白质相互作用的影响。同型对照抗体应与一抗的宿主物种、同型和标记方式相匹配。例如,如果一抗是FITC标记的小鼠IgG1,那么您需要选择一款FITC标记的小鼠IgG1同型对照。大多数同型对照抗体是单克隆抗体,多克隆抗体不适用,因为多克隆抗体含有多个IgG亚类。

Q: 用哪种缓冲液来储存抗体?

我们使用0.01M PBS缓冲液(pH 7.4)加入50%甘油。

Q: 您可以提供哪种类型的抗体标记?

我们目前提供FITC、HRP、生物素等随机标记在游离的赖氨酸(Lys)氨基上的标记。

Q: 为什么有些抗体不再提供?

我们从库存中剔除这些抗体,是因为我们有新的产品替代它们。

Q: 为什么在免疫印迹(Western Blot)中没有带状物?

可能存在的原因有:

a. 抗体不足。一些抗体可能与目标蛋白的亲和性较差。您应该减少抗体的稀释倍数(比推荐的起始稀释度低2-4倍)。同时,抗体可能已失去活性,您应该进行点印迹(Dot Blot)实验。

b. 蛋白质不足。您应该提高在凝胶上加载的总蛋白质量。通过其他方法确认蛋白质的存在。使用阳性对照(重组蛋白、细胞系或处理细胞以表达感兴趣的分析物)。进行点印迹实验。

c. 转膜不良。您应该用甲醇湿润PVDF/Immobilon-P膜,或者用转膜缓冲液湿润硝酸纤维膜,以确保PVDF膜与凝胶之间有良好接触。

d. 转膜不全部。您应该延长转膜时间,因为一些分子量较大的蛋白质可能需要更长的转膜时间。

e. 过度转膜。对于分子量较小(低于10 kDa)的蛋白质,您应该减少转膜电压或时间。

f. 等电点大于9。您应该使用更高pH值的替代缓冲体系,如CAPS(pH 10.5)。

g. 使用了错误的二抗。您应该确认一抗的宿主物种和抗体类型,以选择正确的二抗。

h. 抗体无效。不要使用过期的抗体。

i. 存在偶氮二碘苯酚(Sodium azide)污染。确保缓冲液不含偶氮二碘苯酚,因为它可能熄灭HRP信号。

j. 一抗的孵育时间不足。您应该延长一抗的孵育时间,最好过夜孵育在4℃。

Q: 在免疫印迹(Western Blot)中为什么信号弱?

可能存在的原因有:

a. 蛋白质与抗体结合较弱。您应该尽量减少洗涤次数。减少抗体溶液中的NaCl浓度,或者在洗涤步骤中使用印迹缓冲液(推荐范围为0.15 M-0.5 M)。

b. 抗体不足。您应该将抗体浓度增加到比推荐的起始浓度高2-4倍。

c. 蛋白质不足。您应该提高在凝胶上加载的总蛋白质量。

d. 反应偶联不活性。您应该在管中混合酶和底物。如果颜色不显现或者颜色较弱,可以制备新的试剂或购买新的试剂。尝试使用ECL。

e. ECL试剂过弱/过旧。您应该购买新的ECL试剂。

f. 脱脂奶可能掩盖了某些抗原。您应该减少阻断液中脱脂奶的百分比,或者用3%牛血清白蛋白(BSA)代替。

点击下方链接可查看不同原因对应的解决方案

Q: 为什么在免疫印迹(Western Blot)中出现额外的带状物?

可能存在的原因有:

a. 主抗体的非特异性结合。您应该增加主抗体的稀释倍数。减少在凝胶上加载的总蛋白质量。使用单克隆抗体或抗原亲和纯化的抗体。

b. 二抗的非特异性结合。您应该进行一个只用二抗的对照试验(不加主抗体)。如果出现条带,则选择其他二抗,使用单克隆抗体或抗原亲和纯化的抗体。

c. 分析物的降解。您应该尽量减少样品的冻融循环,存储前向样品中添加蛋白酶抑制剂,或制备新鲜样品。

d. 分析物的聚集。您应该增加DTT的用量以确保还原二硫键(20-100 mM DTT)。在加载凝胶前,将样品置于沸水中煮沸5—10分钟。进行短时间的离心。

e. 试剂的污染。您应该检查缓冲液是否被污染,或者尝试制备新鲜的试剂。

Q: 在免疫印迹(Western Blot)中为什么会出现条状模糊?

可能存在的原因有:

a. 主抗体的非特异性结合。您应该将单克隆抗体或抗原亲和纯化的抗体以更低的浓度稀释在5%牛奶中,或者调整非脱脂奶粉(2%-5%)或NaCl(0.15-0.5 M)浓度作为主抗体溶液。

b. 二抗的非特异性结合。您应该进行一个只用二抗的对照实验(不加主抗体)。如果在膜上出现了条带,则应该稀释该抗体或尝试其他二抗。

c. 阻断不足。您应该使用含有0.1%—0.5% Tween 20、0.15-0.5 M NaCl和25 mM Tris (pH 7.4)的5%脱脂奶粉溶液进行阻断。可以延长阻断时间。根据需要调整奶粉浓度。在4℃下过夜阻断可能会降低阻断效果,因为低温下洗涤剂可能不起作用。

d. 洗涤不足。您应该增加洗涤缓冲液中Tween 20的浓度(0.1%—0.5%),或增加洗涤次数。

e. 脱脂奶粉中可能含有目标抗原或内源性生物素,并且与亲和素/链霉亲和素不相容。您应该使用3% BSA进行替代。

f. 某些IgY抗体可能会识别奶蛋白。您应该使用3% BSA进行替代。

g. 胶片曝光过度。您应该减少曝光时间。如果目标信号过强,请多等待5—10分钟后重新曝光胶片。

Q: 在免疫印迹(Western Blot)中,为什么条带看起来模糊且不规则?

可能存在的原因有:

a. 凝胶不好。在填充之前应全部搅拌溶液。

b. 某些样品的盐浓度较高。您应该对样品进行脱盐或调整盐浓度。

c. 每个孔中的样品体积不一致。您应该调整样品体积,使其基本相同。

d. 缓冲液不起作用。您应该购买新的缓冲液或制备新的缓冲液。

e. 膜中有气泡困住。在转膜过程中要小心地去除任何气泡。

f. 电泳过程中温度过高。您应该减小电流或电压。

点击下方链接可查看不同原因对应的解决方案

Q: 在免疫印迹(Western Blot)中,为什么转膜效率低?

可能存在的原因有:

a. pH值接近等电点。您应该增加转膜缓冲液的pH值。

b. 膜中有气泡困住。在转膜过程中要小心地去除任何气泡。

c. 滤纸接触。滤纸、转膜和凝胶的大小应基本相同,以避免滤纸直接接触。

d. 转膜选择不当。您应该使用可靠的PVDF膜或硝酸纤维膜。

e. 电压或电流过低。我们建议在湿转膜过程中使用20 mA的恒定电流,半干转膜时使用25 V的恒定电压。

f. 转膜时间过长或过短。根据蛋白质的大小和使用的电泳设备,选择适当的转膜时间。

g. 湿转膜过程中环境温度过高。您应该使用预冷的转膜缓冲液或将装置设置为4℃。

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Q: 在免疫组织化学染色中,为什么染色缺失?

可能存在的原因有:

a. 缺乏抗原。我们建议通过原位杂交检测蛋白质的表达,因为在某些罕见情况下,即使已检测到mRNA,蛋白质的翻译可能被阻断。

b. 抗原在与一抗孵育之前被破坏。如果在添加一抗之前进行了内源性过氧化物酶的消除,您应该在与一抗孵育后对过氧化物酶进行阻断。

c. 抗原恢复效果不好。您应该增加处理时间或更换处理溶液。

d. 抗体因存储不当而失效。您应该按照手册上的存储说明操作。通常将抗体分装成足够制备单次实验的小体积,避免反复冻融。

e. 一抗或二抗失活。您应该独立测试报告系统以评估试剂的有效性。

f. 一抗和二抗不兼容。您应该使用能与一抗相互作用的二抗。例如,如果一抗是兔源的,则使用抗兔二抗。

g. 组织固定不充分。您可以尝试增加固定时间或尝试不同的固定剂。

h. 组织过度固定。您应该减少浸泡或后固定步骤的时间。如果无法避免浸泡固定,可以通过使用抗原恢复试剂来使抗原重新显露。

i. 抗原在固定或包埋过程中发生变化。您可以尝试通过各种抗原恢复技术来恢复免疫反应性。

j. 遗漏或错误使用试剂。您应该重复染色,并确认正确使用了正确顺序的试剂。

Q: 在免疫组织化学染色中,为什么染色结果不合适?

可能存在的原因有:

a. 固定方法对抗原不适用。您可以尝试不同的固定剂或增加固定时间。

b. 抗原恢复方法对该抗原或组织不适用。您可以尝试不同的抗原恢复条件。

c. 抗原的静电荷发生了变化。您可以尝试调整抗体稀释液的pH值或阳离子浓度。

d. 固定延迟导致抗原扩散。您应该及时固定组织,并尝试使用交联固定剂而不是有机(醇)固定剂。

Q: 在免疫组织化学染色中,为什么背景较高?

可能存在的原因有:

a. 一抗和/或二抗浓度过高。您应该进行滴定实验,确定促进一抗和二抗特异反应所需的最佳浓度。

b. 一抗或二抗与组织的非特异性结合。您应该在一抗孵育之前进行阻断步骤。非脂乳粉是另一个选择。

c. 二抗的非特异性结合。您应该使用去除了交叉反应IgG物种的抗体(对样本物种进行吸附)。

d. 抗体与组织中的蛋白质之间的疏水相互作用。您应该降低抗体稀释液的离子强度。

e. 背景由离子相互作用引起。您应该增加稀释缓冲液的离子强度。

f. 组织变干。在染色过程中避免组织变干。

g. 试剂附着在老旧或准备不良的玻片上。您应该重新准备新鲜的或购买的玻片。

Q: 在免疫组织化学染色中,为什么组织或细胞形态会被破坏?

可能存在的原因有:

a. 抗原恢复方法过于严酷。您应该根据经验确定能够保持组织形态的条件,同时恢复抗原的免疫活性。

b. 组织切片脱落玻片。您应该增加固定时间。根据经验确定额外或替代性的固定剂。使用新鲜制备的、电荷充足的玻片。

c. 染色过程中未全部固定导致物理损伤组织或细胞。您应该增加固定时间和/或增加后固定步骤。增加固定剂/组织比例。切割更小的组织块以进行更全部地浸润固定。

d. 组织自溶导致坏死碎片染色。您应该增加固定时间和比例。考虑使用交联固定剂。

e. 组织切片出现撕裂或折叠。您应该在切片下除去气泡。使用锋利的刀片重新切割切片,或在分析结果时忽略损坏区域。

f. 组织形态分辨率差。对于冰冻切片,应该切割更薄的组织切片,因为冰晶可能破坏了组织形态。

Q: 在免疫沉淀(IP)中,为什么会有太多的抗体洗脱?

您应该在进行免疫沉淀前将抗体与珠子混合,并使用温和的甘氨酸缓冲液梯度洗脱,这样可以显著减少抗体的数量。

Q: 为什么免疫沉淀(IP)中的背景太高?

可能存在的原因有:

a. 抗体与非特异性结合过多。您应该使用纯化的抗体,并减少使用的量。

b. 细胞过多/蛋白质过多导致洗脱物中存在大量非特异性蛋白质。减少使用的细胞数量/裂解液(10-500 µg)。

c. 不能溶解的蛋白质残留。在离心后立即去除上清液。这样应该将不溶性蛋白质留在沉淀中。如果重新悬浮发生,再次离心。

d. 准备的珠子过少。您应该确保BSA新鲜,并使用足够的珠子在PBS中含有1%的BSA中孵育1小时。在使用之前用PBS洗涤3—4次。

e. 洗涤不干净。您应该在相关阶段进行充分的洗涤,将盖子盖在离心管上,并在离心之前多次倒置。

f. 在免疫沉淀过程中,抗原降解。您应该在裂解之前添加新鲜的蛋白酶抑制剂。

Q: 在染色质免疫沉淀(ChIP)中,为什么大区域显示低分辨率且背景噪音高?

您应该优化DNA片段(不超过1.5 kb)。

Q: 为什么在染色质免疫沉淀(ChIP)中样本中无法扩增DNA?

您应该选择阳性对照模板DNA来确认引物的工作情况。

Q: 在流式细胞术(FC)中为什么会有高背景?

可能存在的原因有:

a. 增益设置过高。您应该降低增益以减少信号,并使用阳性对照来正确设置流式细胞仪。

b. 抗体过多。您应该减少抗体浓度。

Q: 为什么在流式细胞术(FC)中观察到两个或更多的细胞群体?

可能存在的原因有:

a. 存在多个细胞群体表达目标蛋白。您应该检查细胞分离是否充分。

b. 存在细胞二聚体。细胞二聚体将显示为图上大约两倍荧光强度的第二个细胞群体。您应该在染色之前和在流式细胞仪上运行之前使用移液管轻轻混合细胞。

Q: 我应该如何储存和分装抗体?

抗体在室温下只稳定几天。请在收到后将抗体分装并储存在-20℃。请避免反复冻结和解冻,您可以根据实验中使用的量来分装抗体,但每个分装物的量不应少于10 μL。每个分装物的量越小,液体蒸发和容器吸附对抗体浓度的影响就越大。


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