猪胰腺弹性蛋白酶活性的测定

用 Suc-Ala-Ala-Ala-pNA作为底物进行测定

所需材料

1.      Tris缓冲液；0.1 M Tris pH 8.3，25°C。将 6.75 g Tris-HCl 和 8.14 G Tris 碱溶解在 900 ml H ₂ O 中。在 25°C 下测定 pH 值。如有必要，用 0.1 M HCl 或 0.1 M NaOH 滴定至 pH 8.3。用 H ₂ O稀释至 1000 ml。
 

2.      NaOAc-NaCl缓冲液；0.05 M NaOAc pH 5，含有 0.1 M NaCl。将 14.8 ml 0.2 M HAc 和 35.2 ml 0.2 M NaOAc 以及 100 ml 0.2 M NaCl 混合。用 H ₂ O 定容至 200 ml。在 25°C 下滴定至 pH 5。
 

3.      底物溶液；0.1 M Tris pH 8.3 中为 2.5 mM。使用 25 mg 小瓶 N-Suc-Ala-Ala-Ala-pNA（EPC 编号 NS945），用 22 ml tris 缓冲液溶解内容物。（注：使用约 10 ml 缓冲液冲洗底物瓶 5 次。）搅拌溶解。储存于 5°C。
 

4.      弹性蛋白酶溶液；将 1.0 mg/ml 溶解在 NaOAc-NaCl 缓冲液中。在相同的缓冲液中制备每毫升 0.10 毫克的二级溶液。将两种溶液置于冰浴中保持低温。
 

程序

1.      将分光光度计调节至 410 nm，池温度调节至 25°C。
 

2.      将池中 2.5 ml Tris 缓冲液和 0.5 ml 底物溶液平衡至 25°。
 

3.      添加 0.005 ml 0.10 mg ml 弹性蛋白酶溶液，混合并以 1 分钟为间隔测定吸收率的增加率。利率增幅应约为。0.025 – 0.040 Δ ₄₁₀  nm 每分钟。

比活度的计算

Î, 1%, 280 = 19.5 对于猪胰腺弹性蛋白酶

毫克/毫升 = A ₂₈₀  x 0.51

体积 = 3.005 ml A=410 nm T=25°C 光程=1.0 cm

8.8=pNA在410 nm处的mM消光系数 

单位  =   ΔA ₄₁₀  x 3.005 毫升
毫克 8.8 x 0.0005 毫克

品牌  ELASTIN PRODUCTS COMPANY

猪胰腺弹性蛋白酶多克隆抗体，编号 PR121

抗原：猪胰腺弹性蛋白酶，（EPC 号 EC134）

从用纯化的猪胰腺弹性蛋白酶（EPC No. EC134）免疫的兔子获得的全血清。