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WB,IP,IHC,IF,ChIP,FC所用的抗体有什么区别?

发布时间: 2021-11-14  点击次数: 99次

生物医学科研工作者的科研基本离不开抗体,WBwestern blot,IP(immunoprecipitation), IHC(immunohistochemical 免疫组化),IF(immunofluorescence 免疫荧光),ChIP(Chromatin immunoprecipitation)FC(flowcytometry 流式细胞) 都需要用到抗体,那么这几种实验方法中的抗体有什么区别呢?

 

我们在CST上面找p53的抗体,得到了如下的页面

可以看出p53抗体有很多种,并且每种抗体能做的实验还都不一样,那么为什么不同的抗体能做的实验不一样呢?这要从抗体是如何制备的开始。

1. 如何才能成为一个优秀的抗原?

制备抗体之前最重要的是如何制备抗原。一个良好即优秀的抗原应该具备的素质是

a. 分子足够大。 我们知道抗原与抗原之间的区别是由抗原决定族决定的,抗原决定族又叫做表位(epitope),这些表位通常是由6-8个氨基酸组成的。而且要5-10kD才有一个表位,所以一些分子量太小的蛋白质或者多肽很难有一个表位的,也很难作为一个合格优秀的抗原。注意表位有两种形式,一种是线性表位,即由氨基酸的序列决定的。另外一种是构象表位,是由氨基酸的空间结构决定的。两个相隔很远的氨基酸序列在空间结构上靠在一起可以形成一个结构表位。

b. 外源性强。我们常常将抗原注射到动物内体得到抗体,因此抗原必须要与该动物体内的成分区别性大,因为动物对自身的物质形成了免疫耐受,如果抗原与动物自身的物质非常相似,则很难引起强烈的免疫应答,也很难得到好的抗体。

c. 结构尽量复杂。有些物质即使分子量很大也不能算是一个合格的抗原,比如明胶分子量特别大,也属于外源性强的物质。但是明胶的氨基酸基本上是直链的氨基酸,在体内容易被降解,类似的淀粉、核酸、多聚赖氨酸也是一样,不是一个合格的抗原。

2. 制备抗体中常用获得抗原的方式有哪些?

a. 人工合成多肽。很多家族蛋白相似度很高,比如actin家族中 a-actin, b-actin, r-actin三者之间非常相似,基本上只差几个氨基酸,而这些差别的氨基酸往往还被包裹在内部。因此只有人工合成这些差别的序列多肽,才可能区分开这三种相似的蛋白质。制备出来的抗体大部分是识别线性结构的蛋白质。

b. 纯化的重组蛋白。重组蛋白比较容易获得,而且能够获得比较高的纯度。但是在重组蛋白中我们为了纯化往往要加入一段标签(比如GST His, Flag等),拿这些带有标签的重组蛋白去免疫动物,自然也会得到对标签识别的抗体。我们常常用His作为标签,因为它比较小,而且免疫原性比较弱,产生的抗体可以忽略。制备的抗体可以识别线性结构的蛋白质,也可以识别天然折叠状态下的蛋白质。

c. 纯化的天然蛋白。天然蛋白存在修饰,结构复杂,因此是用来做抗体zui 好的抗原。但是很遗憾天然蛋白很难达到较高的纯度。制备出来的抗体最优是识别天然状态下的蛋白质,对线性结构的也能识别。

3. WBIPIHCIFChIPFC之间对抗体需求有什么区别?

在理解上面技术对抗体需求的区别之前我们首先要知道这些实验技术都需要什么样的抗体。

a. WB. WB的蛋白经过加热变性之后都变成线性的结构。因此zui 好的抗体是采用非常特异序列的人工合成多肽的方法来做实验,结果也非常特异。

b. IP/CHIP. 我们用抗体去结合生理状态下的蛋白质,因此IP的抗体最好使用纯化的天然蛋白制作的抗体来做,也可以用纯化的重组蛋白的抗体。最好不要用人工合成多肽制作的抗体,因为这种抗体识别的位点可能被深深地藏在了蛋白的内心深处。CHIP和IP没有太大的区别,wei一的问题在于,如果抗体识别的表位和该蛋白质与DNA结合的部位一致,则会导致CHIP实验的失败。

c. IF/IHC. 免疫荧光和免疫组化中需要进行固定一步,固定是为了尽量让细胞的形态结构维持和原有的一致。这种化学物质的固定使蛋白质变性凝固,与天然状态下的蛋白质有了一定的区别,但是又不同WB中加热变性变成了线性的结构。因此在做IF/IHC实验中,最合适的抗体可以是纯化的重组蛋白得到的抗体,也可以是人工合成多肽得到的抗体(多肽是在蛋白质的表面)

d. FC. 流式细胞中分为两种,一种是活细胞的流式,这种流失最好采用是天然蛋白或者重组蛋白的抗体来做,另外一种是经过固定之后的流式,和IF/IHC 所用抗体一致。 在做流式细胞中,我们有直接标记和间接标记,间接标记不如直接标记真实准确。因此我们选择流式抗体要采用带有荧光标记的抗体;如果研究的蛋白没有直接标记的抗体,那么就采用间接标记抗体,需要添加荧光二抗。

 

4. 常见的问题

a. 做流式的抗体和免疫组化的抗体是一样的吗?

不一定能通用。流式是用直接标记还是间接标记?如果是直接标记的话,那这个抗体一般不是FITC标记或者就是TRITCPE之类的。如果恰好你的免疫组化,也是想用荧光素标记的抗体来直接标记,那就可以通用。如果你的免疫组化要用其它的标记的话,或者是间接标记的话,就有麻烦,因为荧光素的标记很可能会影响二抗和一抗的结合。

b. 为什么我的抗体做WB非常好,而做不了IFIHC等其他任何实验?

首先恭喜你有一个WB非常好的抗体,毕竟能获得做WB非常好的抗体也不容易。其次,你这个抗体很可能是通过人工合成多肽得到的,和上面所述,你用来做抗原的多肽恰好被包埋在蛋白质的中心,因此只能识别WB中线性的部分。

c. 如何选择免疫组化抗体?

首先,一抗是选择单克隆抗体还是多克隆抗体,单克隆抗体特异性强,灵敏度低;多克隆抗体灵敏度高,特异性弱。根据你的实验结果,如果非特异多,那么选择单克隆抗体;如果阳性信号弱,不妨选择多克隆抗体试试。一般家兔来源的都是多克隆,小鼠来源的是单克隆。其次是要弄明白该一抗能够识别什么种属的抗原,抗体说明书上面一般注明有,比如小鼠Mus, 大鼠Rat, Hum。再次比较重要的是要注意一抗的来源。比如我们在人的癌组织中做p53的免疫组化,一抗我们采用的是小鼠来源的p53抗体,那么二抗我们一定要选择 抗小鼠的二抗比如(山羊抗小鼠,兔抗小鼠),这一点非常重要。最后,一般的抗体说明书都会注明能做什么实验,如果标明了不可以做免疫组化,一定不要选择;反过来说,即使标明了可以做免疫组化,也不一定能够做,商家只会夸大其效果。

d. WBIF的二抗是一样的吗?

很明显,不是!免疫荧光抗体是用于 免疫荧光试验的,是用FITCPE等标记的抗体,结果需要紫外线激发并用荧光显微镜观察WB抗体一般是HRP或碱性磷酸酶等标记的抗体,需显色底物(如OPD\TMB等)直接显色(肉眼)或化学发光法显影(需特殊仪器)。

e. CHIP的抗体是否可以用来做WB抗体?

不一定,一般来说做CHIP级别的抗体对抗体纯度特异性方面都要求比较高,基本上能做CHIP的抗体都可以做WB。但是如果CHIP的抗体识别的是构象表位(比如是由两个实际靠在一起但变为线性结构之后相隔很远的两端序列),而不是线性表位,这种CHIP抗体做不了WB

f. 抗体说明书上面没有写该抗体能够用于某项实验怎么办?

一般而言,抗体研发出来之后都要经过WBIPIFIHC实验。档发现浓度不够做IFIHC时候,国外的抗体一般都是写未检测,国内的抗体一般是不写。所以尽量不要抱着试试的心里去尝试,往往只会浪费时间。你想啊,如果抗体能够做该实验,他们肯定会写上去啊。

g. ELISA的抗体能否用来做WB

通常用WB抗体稀释浓度为1:1000IF/IHC1:100,而如果可以做ELISA则可以稀释1:10000。如果一个抗体用来做ELISA的,那么言外之意就是该抗体效价不高。但不是说ELISA的抗体不能用于做WB,抗体说明书提示做ELISA稀释比例为1:1000,那么你可以试试1:100做做WB


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