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如何生产mRNA?

发布时间: 2023-08-29  点击次数: 257次

mRNA(信使核糖核酸)疫苗是一种能够激发人体自身对特定抗原免疫反应的新型技术,它携带有mRNA的信息,其中包括特定病毒特征(即病毒抗原)的“蓝本"或者代码。这些信息使人体能够自行合成病毒抗原:mRNA将生产抗原所需的信息输送到人体制造蛋白的细胞机器中,然后,人体细胞将抗原呈递到细胞表面,从而诱导所需的特定免疫反应。当人体接触到对应的病毒时,免疫系统会识别出特定抗原,从而精准且迅速地攻击病毒来阻止感染。

mRNA的生产过程——

1DNA原液制备;

我们首先需要设计与构建含有S蛋白基因序列的载体,然后通过大肠杆菌放大培养,获得大量的携带S蛋白基因序列的质粒。

2mRNA原液的制备;

获取的携带S蛋白基因序列的质粒线性化{噬菌体启动子(T7-5 UTR-开放阅读框(ORF-3 个非翻译区(UTR-polyA}通过体外转录IVT将前mRNA5'端加帽子。后续需要经过一系列的纯化,除菌等过程。除去酶、游离核苷酸、残留 DNA 和外源 RNA 片段,dsRNA, 及反应体系中的免疫原性杂质。满足 GMP 生产的质量需求。

ModernamRNA还需要把尿苷替换成假尿苷,以降低免疫原性。

3、利用脂质微粒进行包封。

制备递送系统,例如基于聚合物或脂质的纳米颗粒(LNP),然后使用不同制造商不同的方法将纯化的mRNA封装在其中。由此产生的mRNA/递送纳米颗粒组件经过浓缩、缓冲液交换和无菌过滤。然后最终评估并按此顺序包装成袋/瓶作为原料药。原料药通常在最终形成(尽管不适用于某些工艺)最终药物产品填充之前冷冻储存,在某些情况下随后还需要进行冻干。

NGS及合成技术的快速发展的今天,病毒遗传信息序列的解读及序列合成已不是难题。如何将合成好的mRNA序列递送进入人体细胞变成了mRNA疫苗研发的重要挑战之一。

人体细胞结构从外至内可分为细胞膜(cell membrane)、细胞质(cytoplasm)、细胞核(nucleus)。mRNA翻译成蛋白质的过程发生在细胞质中,因此,mRNA疫苗要发挥作用,必须先将编辑好的mRNA递送进细胞质中。

进入细胞质需要通过细胞膜,细胞膜由磷脂双分子层构成,磷脂分子头部具有亲水性,尾部具有疏水性,两层磷脂尾部相对形成双分子层,能够有效控制水分子、离子、大分子物质通过。mRNA作为大分子(300-5000kDa),在不破坏细胞膜的前提下,进出细胞只能以内含体(endosome)通过胞吞作用(endocytosis

通常情况下,内含体进入细胞质后,会被直接送至溶酶体(lysosome)进行分解。为保证mRNA在翻译前保持完整性,mRNA需要在内含体与溶酶体结合前打破内含体包膜(endosomal disruption)并逃离。

逃离内含体进入细胞质后,mRNA便会在细胞质内游动,直至到达核糖体(ribosome)并在此转译为肽链,最终折叠成为蛋白质。

对于mRNA疫苗和药物,递送系统有两大职责:

1、有效包裹和保护mRNA在到达靶点前维持稳定,

2、帮助mRNA有效成分进入细胞,

3、在mRNA到达溶酶体前将其释放进入细胞质中。

LNP是目前有潜力的递送载体之一。LNPLipid Nanoparticle)是脂质微粒的总称,其中又包括脂质胶团(micelle)、脂质体(liposome)等。LNP与细胞膜的组成成分相似,均由脂质分子构成。脂质分子的两条长尾通常呈平行状态,在此状态下,脂质形成的双分子层稳定。

在进入细胞质酸性环境后,部分脂质的头部质子化,呈现阳离子形态,与其他阴性离子态的脂质分子相吸引,尾部张开。原本双分子层的形式被破坏,形成头部聚集在一起的环状。之前包裹在内的mRNA便可逃逸出内含体,进入细胞质翻译。

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