原代细胞的培养及建系之原代细胞的培养篇

前面写了原代细胞的取代、分离，今天讲述一下原代细胞的培养：

第三节 原代和传代细胞的培养和维持   
一、原代细胞的培养与维持   
(一)原代细胞培养   
1、静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞的培养)   
凡经消化液处理实体组织来源的细胞要通过充分漂洗，以尽量除去消化液的毒性，细胞接种时浓度要稍大一些，至少为5×108细胞/L，培养基可用Eagle(MEM)或DNEM培养，小牛血清浓度为10%～80%，有条件的应在37℃ 5% CO2的培养箱中培养，在起始的2天中尽量减少振荡，以防止刚贴壁的细胞发生脱落，漂浮。若原代贴壁细胞不是用于长期培养，只是用于分离繁殖或测定病毒之用，其细胞浓度可以加大，尽量贴成厚层以利病毒的效价提高和测定结果（如空斑）更加明显、准确，待细胞基本贴壁伸展并逐渐形成网状，此时的pH若有明显变化，应将原代细胞换液，即倒去旧液，换入新鲜的培养基，以便除去衰老、死亡的细胞和陈旧的培养基，使贴壁细胞能获得充足的营养。   
若用骨髓或外周血中的悬浮细胞经静置培养1周时，可有少量的肌样纤维间质细胞或基质细胞开始贴壁生长，为了利于该贴壁细胞充分贴壁和生长，此时换液应将细胞悬液经低速离心后，按半量换液方式弃去旧液加入新液，然后再将细胞悬液放入原瓶中继续培养，经反复几次换液后，贴壁肌样细胞逐渐形成网状，此时换液可将原悬浮细胞和培养基移入另一新瓶，然后分别补加新鲜培养基(也按半量换液方式分别对半加入新液)继续培养，原瓶的贴壁细胞逐渐长成单层，而新瓶中又会出现二次贴壁细胞，经几次换液也会逐渐长成单层，在此类细胞培养时，培养基中往往需加入少量的维生素D3、bFGF、地塞米松、小牛血清（浓度要在20%以上），以利细胞贴壁生长。   
2、悬浮细胞的培养   
凡来自外周血、胸腹水、脾脏、淋巴结、骨髓的淋巴细胞、造血干细胞以及白血病细胞，在原代培养时要尽量去除红细胞。若作用于试验的短期培养，可在含10%小牛血清的RPMI1640培养基中进行培养，细胞浓度可在5～8×109/L范围内，然后进行分瓶试验。若要将淋巴细胞及白血病细胞进行长期培养，淋巴细胞中要加入生长因子，白血病细胞中要加入少量的原患者血清，以利细胞生长，待细胞开始增殖甚至结成小团块，培养基中pH变酸，说明细胞生长繁殖良好，一般每隔3天需半量换液一次（换液时尽量使细胞不丢失），待细胞增殖加快，浓度明显增加，pH发生明显变化时，此时可考虑传代。但千万不能急于传代，一定要待细胞密度较高时才能进行，以防传代失败。  

(二)原代细胞的维持   
1、贴壁细胞（包括半贴壁细胞的换液）   
贴壁细胞长成网状或基本单层时，由于营养缺乏，代谢产物增多，pH变酸，不适宜细胞生长，此时细胞还未长成单层，未达到饱和密度，仍需继续培养，因此，需采取换液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要。其换液方法比较简单，即弃去旧液，加入与原培养液相同的等量全部培养基。若希望细胞能在较长时间内能维持存活，但不需增殖，此时要换成含2%小牛血清的维持液。   
2、悬浮细胞   
凡经培养后只在细胞培养基中悬浮生长而不贴壁的细胞，需在倒置显微镜下方可观察到细胞的形态和生长现象，淋巴细胞的短期培养无需换液，但加入生长因子或有丝分裂源（PHA、PMA、COnA、PWM、LPS等）后，细胞不仅会发生转化而且会发生分裂繁殖，此时培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求，加之代谢产物增多，pH变酸，细胞不适宜生长，需进行换液。白血病细胞或淋巴瘤细胞体外长期培养时，都需换液培养，待达到饱和密度时才能传代。换液时，只能采用半量换液的方式，千万不能采取倒去旧液加入新液的方式进行换液。 
半量换液的方法如下：   
将原培养瓶竖起，在30分钟内，若细胞沉于瓶底，可用吸管轻轻吸去一半上清弃去，再加入等量的新鲜全部培养基。若细胞不能沉于瓶底，可吸出细胞悬液，采用低速离心（1000r/min 10min）弃去一半上清加入等量的新鲜全部培养基，混匀后再转入原瓶继续培养。   
二、原代细胞培养的第一次传代   
原代培养后由于悬浮细胞增殖，数量增加甚至达饱和密度，贴壁细胞的相互汇合，使整个瓶底逐渐被细胞覆盖，细胞难以继续生长繁殖，需要进行分瓶培养，这种使原代细胞经分散接种的过程称之为传代。每进行一次分离再培养称之为传一代，传至5～10代以内的细胞通常称为次代培养细胞，传至10~20代以上的细胞，通常确定为传代细胞（或称传代细胞系）。然而，传代细胞系的建立，关键是初代培养的第一次传代。 
应注意如下几点：   
(1)细胞生长密度不高时，或未能达到覆盖整个瓶底时不能急于传代。   
(2)原代培养的贴壁细胞多为混杂细胞，形态各异，往往是上皮样细胞和成纤维样细胞并存，采用胰蛋白酶消化时要掌握好消化时间，因成纤维细胞易于脱壁，上皮细胞不易脱壁，因此，可根据需要选用适当的消化时间及时中止消化。在早先传代时，其消化时间比一般已建系的细胞相对长一些。   
(3)吹打已消化的细胞要轻巧，既不能听到有明显的吹打声，又不能有大量泡沫在悬液中形成，以尽可能减少对细胞的机械损伤。   
(4)第一次传代时细胞接种数量要多一些，以利于细胞的生存和繁殖。如果消化分离的细胞悬液有组织块，也一并传入到培养瓶，尽量减少细胞损失。   
(5)第一次传代培养时的pH不能高，宁可偏低一些。此外，小牛血清浓度可适当加大至15%～20%左右。   
三、传代细胞的传代培养   
原代细胞经传代后所形成的传代细胞，可根据不同细胞采取不同的方法进行细胞传代。贴壁生长的细胞用消化法传代，部分贴壁的细胞用直接吹打或用硅胶软刮的刮除法传代。悬浮细胞可采用加入等量新鲜培养基后直接吹打分散进行传代，或用自然沉降法加入新培养基后再吹打分散进行传代。后两种传代方法比较简单，唯有贴壁细胞的消化传代法比较复杂一些。 
现将具体方法介绍如下：   
(1)吸除或倒掉原瓶中的旧培养基（以25mL培养瓶为例）。   
(2)每瓶加入2mL，无钙、镁PBS，漂洗一次后倒掉。   
(3)每瓶加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02鞹A或混合液），轻轻摇动培养瓶，经消化液铺满所有细胞表面，待细胞层略有松动，肉眼可观察到“薄膜"现象时，倒掉消化液，再继续作用2～3分钟，轻轻摇动，细胞层可随残留的消化液呈片状从瓶壁上脱落下来，在显微镜下可发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大，此时应立即终止消化。   
(4)加入全部培养基5mL，用吸管反复吹打瓶壁上的细胞，吹打时要按顺序进行，以确保所有瓶壁均吹打到，吹打时动作要轻柔，不要用力过大，尽可能不要出现泡沫，以避免细胞的机械损伤。   
(5)用计数板计数，计算细胞的浓度，并用培养基调整适当的细胞浓度后再分瓶培养。   
四、传代细胞的建系和维持   
细胞系的维持是培养工作的重要内容，是通过换液传代再换液、再传代和细胞种子冻存来实现的，但对每一个细胞系来说都有其自身的特点，要做好建系的维持须注意以下几点：   
1.细胞档案   
细胞档案要记录好，如组织来源、生物学特性（由形态、生长繁殖曲线、染色体核型情况、代谢特性、分化特性、病毒敏感性、致瘤特性、有无支原体和潜存病毒等）、培养基的要求、传代换液时间、扩增时间(分裂指数)，细胞的特殊遗传标志(标记染色体)等，这些记录对于保证细胞的正常生长，保持细胞的一致和经长期培养细胞特性的变异比较，都有十分重要的意义。   
2.换液传代   
(1)细胞系的传代、换液方法与前相同，但一般都有自身的规律性，因而在继续传代时，要注意保持其稳定的规律性，这样可以减少由于传代时细胞密度的频繁增减或换液时间的不规律而导致细胞生长特性的改变，给以后的实验带来影响。   
(2)多种细胞系维持传代，要严格操作程序，对所用的试剂各系不能交叉，甚至每个细胞系均需单独实验室，传代时各系均分开单独操作，每传5代后，细胞种子均应冻存。传代时均应作好记录，培养瓶上要有明显标记，标记细胞系名称和传代的代数及传代时间。若细胞生长较快，可减去换液程序，每次均可传代。每个传代细胞系，最好能分成2～3条线，分别传代，同时也可在适温或4℃短期存放一瓶，以防止污染丢失。细胞种子的及时冻存不仅可防止污染丢失，而且还可防止因盲目传代而造成细胞变异，此外还可提供不同代次的细胞同时进行对比试验。   
3.细胞系（或株）的鉴定和管理   
当一个细胞系（或株）建立后，专家鉴定可有可无，按国际惯例，只要认真研究，记录完整，资料和结果确切，就可在有关杂志上或刊物上报道细胞的各次实验指标。   
下面为美国标准细胞库或细胞银行（ATCC）入库细胞的基本要求：   
（1）培养简历 组织来源日期、物种、组织来源、性别、年龄、供体正常或异常健康状态，细胞已传代数等。   
（2）冻存液 培养基和保护剂名称。   
（3）细胞活力 冻融前后细胞接种存活率和生长特性(生长繁殖曲线，分裂指数等)。   
（4）培养液 培养基种类和名称、血清来源及浓度。   
（5）细胞形态 类型，如上皮或成纤维细胞等。   
（6）核型 二倍体或多倍体，标记染色体有或无。   
（7）无污染情况 包括细胞、真菌、支原体、原虫和病毒等。   
（8）物种检测 检测同功酶，主要为G6PD和LDH，以证明细胞有无交叉污染。   
（9）免疫检测 一两种血清学检测。   
（10）细胞建立者 建立者姓名、检测者姓名。    
第四节 细胞的纯化和克隆   
体外培养的细胞源于人或动物体内或胚胎组织，其体内的细胞都是混杂生长，每一种组织都有血管和间叶组织，因此，来源于上述组织的培养材料的原代细胞、传代细胞绝大多数都呈混合生长，即有上皮样细胞，又有纤维样细胞，纤维样细胞又包括成纤维细胞、肌细胞、骨细胞、滑膜细胞等，混杂的细胞会直接影响实验结果，而利用体外培养细胞进行实验研究时，为了保证实验结果的可靠性、一致性、稳定性和可重复性，要求采用单一种类细胞来进行实验，这样才能对某一细胞的功能、形态等变化进行一系列研究，因而培养细胞的纯化就成为实验研究的重要一步，甚至需要从混杂的细胞群中分离出单个细胞来进行培养和开展实验研究。   
一、细胞的纯化   
细胞的纯化一般分为两种，即自然纯化和人工纯化。可根据不同细胞种类、来源、实验要求和目的选择采用。   
(一)自然纯化   
自然纯化即利用某一种类细胞的增殖优势，在长期传代过程中靠自然淘汰法，不断排挤其他生长慢的细胞，靠自然增殖的潜力，最后留下生长优势旺的细胞，达到细胞纯化的目的。但这种方法常无法按照需要和实验要求及目的来选择细胞，此法花费时间长，留下来的往往是成纤维细胞。仅有那些恶性变的肿瘤细胞或突变的细胞可以通过此方法而保留下来，不断纯化而建立细胞系。   
(二)人工纯化   
人工纯化，即利用人为手段造成某一细胞生长有利的环境条件，抑制其他细胞的生长从而达到纯化细胞的目的。   

1、细胞因子依赖纯化法   
人和动物组织中某些细胞需要有特殊的细胞因子存在的微环境才能长期存活和生长繁殖，如IL-2是T细胞生长所必需的细胞因子，BCGF是B细胞的生长因子，体外培养中淋巴细胞若加入IL-2就可使T细胞生长繁殖，形成IL-2依赖的T细胞系，如CTLL-2细胞株，而其他细胞则自然被淘汰，采用此法还建立了IL-6依赖的细胞系，如B9、CTD7细胞株。   
2、酶消化法   
酶消化法是比较常用的纯化方法，不仅对贴壁细胞可行，能利用上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，使两者分开，达到纯化的目的，对贴壁细胞与半贴壁及粘附细胞间的分离纯化也是十分有效的。   
（1）上皮细胞与成纤维细胞的分离纯化   
两者在胰蛋白酶的作用下，由于成纤维细胞先脱壁，而上皮细胞要消化相当长的时间才脱壁，特别是在原代细胞初次传代和早期传代中两种差别尤为明显，故可采用多次差别消化方法将上皮细胞和成纤维细胞分开。 
方法如下：   
①采用常规消化传代方式 将0.25%胰蛋白酶注入培养瓶内两次，每次加1mL（25mL培养瓶）来回轻摇1-2次，使胰蛋白酶流过所有细胞表面，然后倒掉。   
②盖好瓶塞（或盖），将培养瓶放在倒置显微镜下观察，发现纤维样细胞变圆，部分脱落，立即加入2mL有血清的培养液终止消化。   
③用弯头吸管轻轻吹打纤维样细胞生长的区域（可事先在镜下用记号笔在培养瓶上划出记号）。吹打时不要用力，也不要吹打上皮细胞生长区域。吹打结束后，再用少量培养液漂洗一遍，然后加入适量培养液于瓶内继续培养，也可重复上述操作再进行一次，隔几日后或下次传代时，再进行上述操作，经过几次处理，就可将成纤维细胞去除或将两者分开。   
（2）骨髓基质肌样细胞的纯化   
在血液细胞和骨髓细胞静置培养时，常有许多肌样细胞和骨髓基质细胞贴壁生长，但也有许多淋巴细胞、单核细胞、粒细胞粘附其上，种类混杂，鉴于粘附细胞贴壁不牢固，也可用酶消化法使粘附细胞脱壁分离，以达到骨髓基质细胞或血液中肌样细胞与淋巴细胞分开和纯化的目的。 
其方法如下：   
①待基质或肌样细胞基本形成单层时，倒去旧液，加入无钙、镁PBS漂洗，并用力摇动后倒掉，反复洗2~3次后，一方面可洗去血清和钙镁离子以助酶消化，另一方面又可使大部分粘附细胞被洗掉，但仍留有不少粘附细胞。   
②将0.25%胰蛋白酶注入培养瓶内，每瓶1mL（25mL培养瓶），轻轻摇动让胰蛋白酶流过细胞表面，作用1~2分钟后再轻轻摇动1~2次后倒去。   
③盖好瓶盖，在普通显微镜下观察，发现基质或肌样细胞由于贴壁较牢固未脱壁，而原先粘附的细胞已浮起，此时再加2mL PBS洗一次倒掉，尽量除去粘附细胞。   
④加入含血清的培养基终止消化，再继续用力摇动后倒掉，加入培养基继续培养。隔几日或下次传代前，再进行上述操作，经过几次处理和传代培养后就可将粘附细胞去除，将两者分开，达到使骨髓基质细胞或肌样细胞纯化的目的。   
3、机械刮除法   
原代培养时,如果上皮细胞和成纤维细胞为分区成片混杂生长，每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁上。可采用机械的方法去除不需要的细胞区域而保留需要的细胞区域。

其方法如下：   

(1)将要纯化细胞的培养瓶，在净化室内放在倒置显微镜监视下进行。   
(2)用硅橡皮刮子在不需要生长的细胞区域推划，使细胞悬浮在培养液中，注意不要伤及所需细胞。   
(3)推划后用培养液冲洗振摇两次倒掉，即可将培养基加入原瓶继续培养。   
(4)数日后如发现不需要的细胞又长出，可再进行上述操作，这样反复多次可以纯化细胞。操作过程中要严格无菌操作，防止污染。   
4、反复贴壁法   
成纤维细胞与上皮细胞相比，其贴壁过程快，大部分细胞能在短时间内（大约10~30min）完成附着过程（但不一定全部伸展），而上皮细胞（大部分）在短时间内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即浮起，利用此差别可以纯化细胞。 
其方法如下：   
(1)将细胞悬液接种在一个培养瓶内（最好培养液内不含血清，此时上皮细胞贴壁更慢）静置20分钟。   
(2)在倒置显微镜下观察，见部分细胞贴壁，稍加摇动也不浮起时，将细胞悬液倒入另一培养瓶中，继续静置培养20min，然后再重复上述操作后，即可将上皮细胞和成纤维细胞分隔开，在第1瓶和第2瓶以成纤维细胞为主，往后几瓶即以上皮细胞为主，下次传代时再按上述方法处理，就可使两者达到全部分开的目的。   
5、电烙筛选法   
在贴壁细胞转化时，往往在培养瓶的细胞层中会出现分散的转化灶，转化灶区域细胞密集、排列规则，有明显生长趋势，与周边未能转化的细胞有明显的区域界限，此时即可用机械刮除法去除未转化细胞，也可用电烙筛选法烫死未转化细胞而保留转化灶细胞。 
其方法如下：   
(1)倒去旧液，并用记号笔划出转化灶的区域。   
(2)用加热的微型电烙器(类似焊接用的电烙铁)将转化灶周边的细胞全部烫死，只保留转化灶细胞。在单细胞克隆筛选时，也可用此法将单个细胞周围的细胞杀死，然后在适应性培养基中（50%是旧液）继续培养，即可达到纯化的目的。   
二、细胞的克隆化   
        细胞克隆技术又称单个细胞分离培养技术，即从细胞群体中分离出一个细胞，并使其在体外培养体系中能繁殖成新的细胞群体，这种由单个细胞所形成的细胞群（或集落）称为一个克隆，这种纯化后的细胞群体称为细胞株。它们当中每个细胞的遗传特征和生物学特性极为相似和一致，有利于对不同群体细胞的形态和功能进行比较和研究。若该细胞株只是一般传代、无一系列实验鉴定指标，则为一般细胞株。若有一系列实验指标报道的，则称为限定性细胞株，如由幼地鼠肾细胞系（BHK21）第13孔的单个细胞形成的细胞株称BHK-21C-13（代表克隆13），其形态规则，特性稳定，便于研究。   

        单一细胞体外培养能否生长繁殖最后形成克隆，这与各细胞克隆形成率有关，如果细胞克隆形成率偏低（小于10%）应采用一些措施，如改用胎牛血清，适应性培养基添加刺激因子（如胰岛素、地塞米松、细胞生长因子等），调节CO2浓度以控制pH。若贴壁效果差可选用适当的适应性底物（如胶原层或血浆纤维蛋白层），以及制备底层的饲养细胞。用X线或60Co照射处理的细胞层，如鸡胚细胞、骨髓基质细胞，该细胞照光后只有代谢功能，无增殖和传代能力，或选用短寿的细胞，常选用鼠腹水巨噬细胞作饲养细胞，用于单克隆抗体杂交瘤细胞的克隆化。
具体克隆方法如下：   
1.毛细管法：   
将一定量的细胞悬液（如105/mL或更低）稀释至1个细胞/mL，取10mL稀释的细胞悬液，用直径为0.5mm，长为8mm的毛细玻璃管若干（30～50只），在负压作用下，使悬液吸入各毛细管中，在倒镜下检查出每管只进入一个细胞的毛细管，然后放入适应性培养基或有饲养层细胞的培养瓶（或培养板）内，在CO2培养箱中培养，由一个细胞在毛细管繁殖后，并向管外扩展，并形成单个克隆的细胞群体。   
2.有限稀释法   
有限稀释法采用梯变倍数稀释的原则，将稀释的细胞悬液接种于微孔培养板中（也可在板上的96孔中直接稀释）培养一定时间后，孔中可出现单个细胞克隆，本法不需特殊设备，操作简单快速，适合大批量克隆化培养。现已广泛用于异质性细胞系的克隆化培养、诱导和分离耐药性或高转移性、或突变细胞株以及单克隆抗体杂交瘤细胞株的克隆筛选中。 
具体方法如下：  
（1）取对数生长期的细胞制成悬液(贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶消化后吹打分散制成)，经台盼蓝染色计数，测定活细胞数及浓度（细胞存活率及单个细胞百分率应高于90%以上）。   
（2）将细胞悬液在试管中稀释，用培养基将细胞稀释至50个细胞/mL、10个细胞/mL、5个细胞/mL，将3种稀释度的细胞分别接种于96孔板中，每孔为0.1mL，于37℃ 5%CO2下培养。   
（3）次日在倒置显微镜下观察培养板各孔中的细胞数，挑选只含一个细胞的孔，做好标记并补加0.1mL培养液继续培养。   
（4）培养期间，视pH值的变化决定是否换液或补加培养液，一周左右，孔中有明显克隆出现，待长至孔底面的1/3～1/2时，可用消化法将96孔中的单一克隆的细胞分别移至24孔板中进行扩大培养。  

3.平皿克隆分离法   
        在平皿内将单个细胞形成克隆并进行分离培养的方法如下：   
(1)将对数生长期细胞制备单个细胞悬液（悬浮细胞用吸管吹打分散，贴壁细胞先用0.25%胰蛋白酶消化后，再用培养基吹打分散）计数并用培养基调整细胞浓度，使5mL培养液内含有50～200个细胞（细胞存活率及单个细胞百分率应大于90%以上）。   
(2)将上述细胞悬液迅速移入60mm平皿中，在37℃ 5% CO2下培养1周或更长。若有明显的克隆形成时方可进行克隆分离，方法有两种：   
①套环法：在倒置显微镜下观察克隆形成的情况， 标记单个克隆周边，吸干培养基，用涂有少量无菌硅脂的无菌金属套环，套住标记的克隆，在套环内滴加少量0.25%胰蛋白酶，待细胞脱离时，用注射器针头轻轻吹打分散后，转入小平皿或24孔板或6孔板中扩大培养。   
②玻片法：在接种细胞悬液前，预先在60mm平皿中放入无菌小玻片，加入细胞悬液，培养一定时间后，在倒置显微镜下标记上含一个克隆的玻片，然后用无菌镊子取出标记玻片转入24孔培养板中继续培养。   
4.软琼脂克隆分离法   
本法仅适用于悬浮培养的类淋巴细胞或恶性程度高的贴壁细胞，而正常贴壁细胞在软琼脂中不能形成克隆。   
（1）将对数生长期的细胞制成单个细胞悬液(贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶消化使之分散成单个细胞)作活细胞计数。调整细胞浓度至1×106细胞/L，然后根据实验要求再作梯倍稀释。通常以1~5×104个细胞/L为佳。   
（2）制备底层琼脂 取5%琼脂置沸水中，使琼脂全部溶化，取出一份5%琼脂，移入小烧杯中，待冷至50℃，迅速加入9份预温37℃的新鲜培养液（即成为0.5%琼脂），混匀后立即注入24孔培养板中，每孔含0.5% 琼脂0.8mL，置室温使琼脂凝固备用（此层也可以省略）。   
（3）制备上层琼脂 取37℃保温的、不同浓度的细胞悬液9.4mL，移入小烧杯中，加入50℃ 5% 琼脂0.6mL迅速混匀，即配成0.3%琼脂培养基，立即浇入铺有底层琼脂的24孔培养板中，每孔0.8ml，置室温使琼脂凝固。   
（4）于37℃ 5% CO2下培养1~2周或更长，若需培养更长时间可补加0.8mL/孔含琼脂的培养液，待有明显集落形成为止。   
（5）集落（克隆）计数：在倒置显微镜下观察并计数直径大于75μm或含有50个细胞以上的克隆。  

5．单细胞显微操作法   
借助显微操纵器，在显微镜监控下将单个细胞逐个吸出，移入含有饲养层细胞的培养板中进行培养。本法准确性好，如无显微操纵器可自制毛细吸管替代。

方法如下：   
（1）饲养层细胞的制备 单个细胞在极低密度下生长非常缓慢，甚至难以分裂，为了促进克隆细胞的生长繁殖，常采用饲养层细胞，饲养细胞种类和制备方法依实验要求而定，现以3T3小鼠纤维细胞为例：   
①用0.25%胰蛋白酶消化单层贴壁生长的3T3细胞，调整细胞浓度为108细胞/L，在96孔板中每孔加入0.1mL细胞悬液于37℃ 5% CO2中培养至单层。   
②将已形成单层的3T3细胞板，用60Co γ线以4000～6000拉得辐射或在培养液中加入mitomycin（终浓度为10-6mol/L）作用16h。其目的是使细胞有丝分裂能力丧失，但仍可短期存活，有代谢功能，不仅可维持pH而且还可为克隆细胞提供必要的养分及刺激生长的因子。饲养细胞处理后需更换新鲜培养液。   
(2)制备单个细胞悬液 方法同上。   
(3)分离单个细胞 其方法多样，可根据实验条件决定：   
①毛细管吸入法 同上述毛细管法，在显微镜下将只有一个细胞的毛细管取出。   
②微滴法 将经稀释至103个细胞/L的单个细胞悬液，用无菌的1mL注射器逐滴加在平皿中制成散滴，在显微镜下挑选出单个细胞的液滴，再用毛细管取出单个细胞悬滴。   
③液体石蜡法 将经稀释至103个细胞/L的单个细胞悬液，用无菌的1mL注射器逐滴加入充满无菌液体石蜡的平皿底部，在倒置显微镜下挑选只有一个细胞液滴，仔细用毛细吸管取出有一个细胞的液滴。   
④玻璃小球附着法 将稀释至103个细胞/L的细胞悬液加入表面涂有无菌凡士林石蜡的小玻璃珠的平皿中，混匀后，在倒置显微镜下挑选玻璃珠表面只粘附一个细胞的玻珠，仔细用镊子取出。   
(4)将采用上述方法分离出的单个细胞，放入预先制备饲养层细胞的96孔培养板中，于37℃ 5% CO2下培养1~2周或更长。   
(5)待细胞克隆明显，并使孔底覆盖1/3～1/2时，即可将细胞转种于24孔板进行扩大培养（贴壁细胞仍需用0.25%胰酶消化法取出转种）。