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HL-SAN热不稳定性耐高盐核酸酶

发布时间: 2023-11-01  点击次数: 224次

 


ArcticZymes Technologies成立于20世纪80年代后期,总部位于挪威北部的特罗姆瑟(Tromsø)。立足北极海洋区,致力于从海洋生物中识别新的冷适应酶,用于分子研究、体外诊断和治疗领域。ArcticZymes专注于与全球的合作伙伴和商业创新者建立牢固可靠的关系。因此,我们一直在探索并开发更加不一样的产品,不断满足并且超过合作伙伴的期望。

HL-SAN热不稳定性耐高盐核酸酶70910-202 

描述

无论是实验室规模样品制备、还是生产规模工艺过程,去除核酸都可以改善工艺流程,如蛋白纯化、病毒载体制备、mNGS中样品处理等过程。而核酸酶的选择,就显得特别重要。Heat Labile-Salt Active Nuclease (热不稳定性耐高盐核酸酶,HL-SAN) 是一种非特异性内切酶,在高盐浓度下具有较佳活性;且该酶在多种缓冲液中都有活性,很容易通过还原剂处理而失活。这些特性使HL-SAN在需要去除DNARNA的应用中,更为适合。

核酸污染,特别是宿主基因组DNA污染,在几乎所有工艺流程及生物制品的生产中,都是需要重点解决的问题。一方面,宿主DNA的存在,影响目标产物的纯化及下游质量分析等。另一方面,宿主DNA残留能引起机体严重的免疫反应,是生物制品的关键质量参数之一,FDANMPA等对Host Cell DNA (HCD)有严格的质控要求。

宿主基因组DNA中,组蛋白与DNA形成核小体,核小体紧密折叠形成结构复杂的染色质。组蛋白与DNA间存在强烈的离子作用及疏水作用,再加上特殊的结构,导致宿主DNA很难被准确检测并清除。已有文献表明,高盐浓度下组蛋白与DNA解离相对很好,这有利于宿主DNA的检测及去除。但市售的绝大多数核酸酶在高盐浓度下活性很弱,甚至全部失活。而耐高盐的HL-SAN成了这类应用的理想选择。

高盐浓度能够提高去除效率

HL-SAN是一种新型的、耐高盐的工程化内切酶。该酶在0.5 M NaCl条件下具有较佳活性,是去除宿主DNA污染的理想选择。

盐浓度是去除过程的重要参数之一。高盐浓度下,宿主DNA与蛋白质能够全部解离,从而更容易被降解。

推荐应用

1. 病原微生物诊断应用,如宏基因组测序(mNGS)样品去除宿主DNA

2. 蛋白纯化,特别是DNA结合蛋白;

3. 病毒载体制备,如腺相关病毒(AAV)、腺病毒(AdV)等;

4. 其他需要去除宿主DNA的应用等。

优势

1. 盐条件下,DNA清除效率更高,宿主DNA残留更少;

2. pI9.6,容易跟绝大多数蛋白分离;

3. 还原剂存在时,酶易失活,减少对后续流程的影响。

4.温度稳定

5.在低温下活跃(6℃时为20%

实验数据:

img1 

img2 

Figure 1. HL-SAN的特性

使用指导

1. DNA去除方案

从细胞抽提物或细胞裂解液中去除DNA污染,HL-SAN的使用量受到多种因素影响,如细胞类型、裂解液组成、NaCl浓度、Mg2+浓度、裂解液pH等。参考方案见Figure 1。比如,对于1ml细胞裂解样品,调整到0.3-0.75 M NaCl浓度,加入1000 U HL-SAN15-37温度条件下孵育30-60min,或者4过夜。Mg2+是必须的

img3 

Figure 2. 不同样品、不同去除要求下,HL-SAN的推荐浓度及反应条件。(DNA removal的要求是指通过琼脂糖凝胶电泳看不到条带。Decontamination的去除要求是对23S rDNA进行qPCR检测为阴性。)

2. 灭活

灭活是通过添加还原剂(TCEPDTT)来实现的,推荐用TCEP(因为TCEP在磷酸盐溶液中不稳定,特别在中性pH下)。不同工艺流程中,通过改变孵育时间、温度和还原剂的浓度等来活该酶。一般情况下, 25-37反应5-10分钟,可以灭活99%以上的酶。为了避免酶恢复活性、再次激活,保持低浓度还原剂,如0.1-0.5 mM DTTTCEP,或延长灭活反应时间。

3. 去除

HL-SANpI9.6,能够紧密结合阳离子交换柱。在pH 9.0条件下用0.2M盐冲洗,柱子的流出液/废液中只有不到0.02%酶脱落。需要注意的是,不推荐使用阴离子交换柱去除HL-SAN,因为HL-SAN的糖基化修饰会结合到柱子上。

img4 

Figure 3. HL-SAN紧密结合在SP-sepharose柱子上(体系是0.2 M盐浓度,pH 9.0)。

应用实例:

高效去除人体DNA (99.99%)干扰、快速检测下呼吸道感染(LRIs)病原

呼吸道感染(RIs)病原的快速检测一直是医疗中亟待解决的问题。RIs样本类型众多并且病原含量差别很大,同时带有大量的人体细胞,因此搭建一套快速、高效的样本处理系统对于通过高通量测序进行病原检测至关重要。

2019Nature Biotechnology文章报道了如下流程。为了尽可能去除宿主DNA、提高检测灵敏度,在优化实验的人体宿主细胞去除、微生物DNA提取和nanopore测序等三个步骤都做了对应的优化,比如宿主DNA去除时找到了合适浓度的saponin2.2%),HL-SAN步骤由两步减为一步,清洗步骤缩减为2次。从拿到样本到建库完成缩短至6hr,且在较终检测中达到了96.6%的敏感性和100%的特异性。img5

Figure4. Nanopore宏基因组快检流程。

热销产品

货号

品名

规格

70910-202

HL-SAN

25000U

70921-202

SAN HQ Triton FREE

25kU

70921-150

SAN HQ Triton FREE >250-500kU

500000units

70800-201

HL-dsDNase2-250

250U

70800-202

HL-dsDNase 2-1000

1000units

70500-201

Cod Uracil-DNA Glycosylase Cod UNG-1-100

100units

71600-201

ArcticZymes Proteinase

50units

71502-201

IoPol BST+ 5-200

200units

71502-001

IsoPol BST+ 10X Reaction Buffer Pack

1units

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