IDT寡核苷酸合成领域的翘楚----CRISPR/Cas9基因编辑技术

美国Integrated DNA Technologies公司（以下简称IDT）创办于1987年，是寡核苷酸合成领域的翘楚，在过去的30多年里IDT致力于为学术研究、农业发展、医疗诊断、药物研发等领域开发和制造核酸产品，IDT可以为客户提供高品质的产品、专业的技术支持和个性化的定制服务。在分子生物学领域，IDT为二代测序、基因编辑、qPCR和RNA干扰等领域开发了一系列专有技术。IDT生产的GMP级别产品被广泛应用于多种癌症以及遗传和感染性疾病的诊断试剂研发，并通过不断优化自动化合成平台的处理技术来加快原研试剂的开发和生产。
       IDT为100多个国家和地区的超过120,000名生命科学研究人员提供服务，每天生产70,000多条核酸产品。IDT针对基因组学应用开发的创新工具和解决方案正在打破研究壁垒，激发您的梦想，实现下一个突破。

一、CRISPR/Cas9系统介绍

       CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。目前，来自Streptococcus pyogenes的CRISPR/Cas9系统应用最为广泛。

       Cas9蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。

      研究人员为了将CRISPR/Cas9技术发展为高效的基因打靶工具，又进行了优化和改造。Cong, L.等人[1]在不影响系统效率的情况下，将crRNA和tracrRNA融合为一条RNA。通过这种简化，CRISPR/Cas9系统现仅包括两个元素：Cas9蛋白和sgRNA（single guide RNA）。因此现在人们将CRISPR/Cas9技术也称为Cas9/sgRNA技术。

♦ 相关名词解释与作用

CRISPR：成簇间隔短回文序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)；
crRNA： (CRISPR RNA)用于识别基因组序列；
tracrRNA： (trans-acting crRNA)用于招募和激活Cas9；
Cas9蛋白：CRISPR-associated genes家族的一员，用于切割DNA，（CRISPR-associated genes家族，包括Cas1、Cas2、Cas4和效应蛋白如Cas9、Cpfl等。可利用其工作机制切割特定DNA片段，从而进行基因编辑。
 该系统非常高效，因此crRNA只需要最少的设计工作。需要提供的是一个与您靶基因中的PAM（前间区序列邻近基序；NGG）序列紧邻的、具有位点特异性的19或20个碱基的序列。注：NGG 代表AGG,TGG,GGG,CGG四种可能，满足其中一种即可。

        总结：crRNA+tracrRNA都是直接得到最佳！

4、辅助试剂

⑴ Purified carrier DNA，通过电穿孔提高Cas9核糖核蛋白(RNP)的递送。专门设计来避免与人类、小鼠和大鼠基因组的同源性

⑵ 小分子化合物，可以提高同源定向修复的比率

⑶g of plasmid.

四、IDT基因编辑关联产品
 

1.Ultramar® 合成

IDT 采用耦合技术，Ultramer® DNA 合成的耦合效率在行业中成为第一，具备生产长达200 bases 单链DNA 的能力。每条Ultramer® DNA 序列都会通过ESI-MS 进行质检。

图. 耦合效率决定序列合成终产物全长序列的比例、如上图所示，Ultramer® 优势在合成长序列时尤为明显。合成200个碱基的序列时，在耦合效率为98.5%的工业标准下，正确合成全长产物比例仅为5%；而耦合效率为99.5%（Ultramer® 技术）时约高达38%。高耦合效率可以保证完整准确的全长序列。

2. HDR Donor Oligos

lt-R™ HDR Donor Oligos旨在增加在基因组编辑实验中homology-directed repair（简称HDR，是细
胞内一种修复DNA双链损伤的机制）的修复率。

这些定制的产品会利用专有的修饰来合成以增加donor oligo的稳定性，从而提高基因组双链断裂后成功组合进基因组的机会。

• 最长200个碱基
• 经过修饰的单链DNA donor oligo
• 3-5天即可发货
• 两种规格可选 2 nmol 或者 10 nmol（可根据客户要求提供大包装）

IDT同样会在网站上发布新的HDR设计工具。工具能够提供多种不同的输入方式用于选择需要编辑的靶标基因组序列，工具包含一个直观的界面，可在编辑区域内进行所需的序列编辑。一旦研究者提供编辑内容及编辑位点的详细说明，这个工具将会提供推荐的CRISPR-Cas9 guide RNAs 和相应的HDR donor oligos。在重新核查后，客户可以轻松下单，并且能够根据需求创建新的基因组变更项目。HDR设计工具同样支持适用于更长基因组变更的Megamer单链DNA片段的订购。
 

3. Custom Gene Synthesis

IDT提供高质量的、序列经验证的人工基因定制合成服务。定制基因和MiniGene™合成基因使用gBlocks®Gene Fragments或Ultramer® DNA Oligos构建，同时配以全面质控以确保基因序列的准确性。
质量控制和序列验证
定制基因和MiniGene™基因产品的全部插入片段均在两条链上进行序列验证。通过Sanger测序进行序列验证；某些情况下，使用MiSeq®系统（Illumina）测序替代Sanger测序。一般情况下，质控结果包括色谱图、质粒图谱和FASTA文件。IDT的基因合成产物终都以质粒形式交付，这个克隆载体可以直接转化到大肠杆菌中。 为了优化生产和交付时间，长度≤5kb的合成基因均插入含有筛选标记的载体，用户可根据需要选择Amp或Kan抗性。 接收到基因产物后，可以使用很多方法将基因序列亚克隆到其他载体中。克隆载体的序列和插入位点等信息在随货文件中可见。
可应用于
· 蛋白表达
· miRNA 基因
· IVT模板
· 基因变异和SNP分析
 

基因编辑相关的周围产品

• ·合成基因可选载体

可能影响合成、组装或测序结果的情况如下

•二级结构：>10个碱基的发夹结构和富含G / C的二级结构
•重复序列和同聚序列：长重复序列，G / C>10个碱基，或A/T>30个碱基
•总体GC含量>65％，区域GC含量<25％
• 限制性位点重复和Dam / Dcm甲基化位点均可能干扰限制内切酶酶切
 
 

4. gBlocks Gene Fragments

gBlocks基因片段是经过序列验证的，长度为125-3000 bp的双链DNA分子片段，采用IDT的Ultramer®DNA Oligos合成技术。具有高准确性、高性价比和应用灵活等特性。
 
 

质量控制和序列验证

•通过毛细管电泳（ Capillary Electrophoresis ，CE）验证片段长度。
•通过质谱（Mass Spectrometry ）鉴定序列。
•在多数情况下，每个gBlocks基因片段重组克隆测序后， 80％*之上的克隆都包含期望的插入片段。

* 如果序列非常复杂，其保真度可能会降低。可以通过适当增加测序的克隆数目来获得序列正确的插入片段         

可应用于：         

           •基因构建和修饰
           •CRISPR的基因&转录形成sgRNA
           •qPCR或PCR的标准品或内参
           •抗体研究，例如制备重组抗体
           •酶工程
           •疫苗研究

5、gBlocks Gene Fragment Libraries

IDT提供含有mixed base的251-500bp的基因片段库，其优势在于：
•可以接受的成本生成多达数十万的构建变体。

•可以自由选择克隆载体与克隆方法，包括Gibson Assembly®方法和平端或黏末端等克隆方案，实现轻松组装

产品详情

合成251-500bp中允许出现1-8个随机碱基“N"的出现。注：N代表A,T,G,C任意一个碱基。
 

6、Megamer Single-Stranded DNA

IDT提供长度为201-2000个碱基的Megamer ssDNA片段，Megamer ssDNA经克隆纯化的DNA生成，因而纯度特别高

         可应用于：           

       · CRISPR介导的基因编辑的同源重组（HDR）            

      ·体外转录（IVT）等应用中。

五、使用文献

1.Vakulskas CA, Dever DP,   et al. (2018) A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells
Nat Med. 24:1216- 1224. doi: 10. 1038/s41591-018-0137-0.
2.Park SH, Lee CM, et al. (2018) Highly efficient editing of the beta-globin gene in patient derived
hematopoietic stem and progenitor cells to treat sickle cell disease. Blood, 132(Suppl 1),2192. doi: 10. 1182/blood-2018-99-l 17371.