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不同细胞转染技术的原理及区别

发布时间: 2023-11-10  点击次数: 141次

常规转染技术可分为两大类,一类是瞬时转染,一类是稳定转染(转染)。前者外源 DNA /RNA不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说,超螺旋质粒DNA转染效率较高,在转染后24-72小时内(依赖于各种不同的构建)分析结果,常常用到一些报告系统如荧光蛋白、β半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染,外源DNA既可以整合到宿主染色体中,也可能作为一种游离体(episome)存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小。大约1/104转染细胞能整合,通常需要通过一些选择性标记,如来氨丙基转移酶(APH;新霉素抗性基因)、潮霉素B磷酸转移酶(HPH)、胸激酶(TK)等反复筛选,得到稳定转染的同源细胞系。


转染方法

原理

王要应用

特点

DEAE-葡萄糖法

带正电的DEAE-葡萄糖与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞

瞬时转染

相对简单、重复比磷酸钙好,但对细胞有一定的毒副作用,转染时需除血清且一般只用于BSC-1、CV-1、COS细胞系

磷酸钙法

磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞

稳定转染,染瞬转染

不适用于元代细胞(所需的DNA浓度较高),操作简便但重复性差,有些细胞不适用细胞建议用CSCL梯度离心,转染拷贝数较多

阳离子脂质体法

带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物,然后脂质体上剩余的电核与细胞膜上的唾液酸残基的负电核结合;另一种解释是通过细胞时内吞左右而被进入细胞。(若DNA浓度过高,中和脂质体表面电核,而降低了与细胞的结合能力)

稳定转染,瞬时转染,所有细胞

使用方法简单,可携带大片段DNA,通用于各种类型的裸露DNA或RNA,能转染各种类型的细胞,没有免疫原性。虽在体外基因转染中有很高的效率,但在体内,能被血清清除,并在肺组织内累积,诱发强烈的抗炎反应,导致高水平的毒性,这在很大程度上限制了其应用

阳离子聚合物

带正电的聚合物与核酸带负电的磷酸基团形成带正电的复合物后与细胞表面带负电的蛋白多糖相互作用,并通过内吞作用进入细胞

稳定转染,瞬时转染,所有细胞

除了具有阳离子脂质体的转染效率高,操作简单,适用范围广,重复性好等特点外,还具有在体内,转染效率高,细胞毒性低等特点,是新一代的转染试剂

病毒导法

逆转录病毒(RNA)

通过病毒中膜糖蛋白和宿主细胞表面的受体相互作用而进入宿主细胞,之后反转入酶启动合成DNA并随机整合到宿主基因组中

稳定转染,特定宿主细胞

可用于难转染细胞、原代细胞,体内细胞等,但携带基因不能太大(<8kb),细胞需处分裂期,需考虑安全因素


腺病毒(双链DNA)

先和细胞表面的受体结合,继而在整合素导下被细胞内吞

稳定转染,特定宿主细胞

可用于难转染细胞,需考虑安全因素


Biolistic颗粒传递法(基因枪粒子轰击法)

将DNA用显微镜金属颗粒沉淀,再将包被好的颗粒用弹道装置投射入细胞,DNA在胞内逐步释放、表达

瞬时性转染,稳定转染

可用于:人的表皮细胞、纤维原细胞、淋巴细胞系以及原代细胞

显微注射法

用显微镜操作将DNA直接注入靶细胞核

稳定转染,瞬时转染

转染细胞数有限,多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞

电穿孔法

高脉冲电压破坏细胞膜电位,DNA通过膜上形成小孔导入

稳定转染,瞬时转染,所有细胞

适用性广,除了质粒外,还可转染大的基因组(>65kb)但细胞致死率高, DNA和细饱用量大,需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件,拷贝数较少


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