Invivogen抗污染抗生素常见问题

Ø抗污染抗生素

细胞培养过程中如何避免细胞污染？

1 进行细胞培养时确保处于无菌环境，并使用恰当的灭菌技术。

2 细胞培养过程中所使用的培养基或添加的培养物均要确保无菌无污染。

3 定期使用显微镜或检测试剂盒监测细胞培养基，以确保无微生物污染。

4 使用抗污染抗生素。在原代细胞培养或克隆过程中微生物污染是难以发现的，Invivogen公司为此设计了具有预防功能的防污染试剂。Invivogen公司可提供的抗污染抗生素有Plasmocin™ prophylactic，Normocin™， Primocin™ 及Fungin™。

如何鉴别细胞培养过程中被哪种微生物污染？

如果细胞培养过程中存在细菌和/或真菌污染，可以使用光学显微镜进行鉴别。因为它们的生长速度很快，可以使细胞培养基出现浑浊或菌斑，一般48小时后即可用肉眼检测。随后可使用检测试剂盒对这些微生物种类进行鉴定。然而，支原体污染不能直接用肉眼观察，也不能通过光学显微镜进行鉴别，只能通过不一样的分析方法（如支原体检测试剂盒）进行检测。因此，在细胞培养过程中支原体污染很容易被忽视。Invivogen提供的PlasmoTest™支原体污染检测试剂盒结果可靠，分析准确，尤其是可以排除假阳性或不确定的结果。

针对不同微生物的污染，应如何选择Invivogen的抗污染抗生素？

在冻存细胞之前的细胞培养过程中，可以添加抗污染抗生素吗？

可以的，在冻存细胞之前可以添加Plasmocin™ prophylactic（预防支原体污染试剂）或广谱抗生素Normocin™。但是，在这之前需使用光学显微镜鉴定细胞是否被细菌或真菌污染，或使用PlasmoTest™支原体检测试剂盒检测是否存在支原体污染。

Invivogen是否可以提供一种可以同时抵抗细菌、真菌、支原体污染的抗生素吗？

Normocin™和Primocin™这两款抗生素是广谱性的，可同时抵御细菌、真菌、支原体的污染。两者的区别是Primocin™推荐用于原代细胞培养中预防微生物的污染，而Normocin™则推荐用于细胞系培养。

在细胞培养过程中可以同时使用Invivogen的抗污染抗生素及基因筛选抗生素吗？抗污染抗生素会影响基因筛选抗生素的作用效果吗？

在细胞培养过程中可同时使用Invivogen的抗污染抗生素及基因筛选抗生素，抗污染抗生素的使用不会干扰常用的基因筛选抗生素的作用效果，例如G418, Blasticidin, Puromycin, Hygromycin B和 Zeocin™。

Ø细菌污染

细胞培养过程中应如何鉴别细菌污染？

由于细菌比真核细胞小很多，因此在细菌污染的早期阶段通常被认为是细胞碎片。这个时候应使用放大倍数为100×-400×的光学显微镜观察细胞培养基的状态。如果观察到黑色斑点、杆状物或螺旋状物，那培养基应该是被细菌污染了。由于细菌生长快速，在污染后的48小时内便可引起培养基的变化，使培养基变浑浊。若培养基中含有酚红，由于细菌的新陈代谢使培养基的pH下降，从而导致培养基的颜色迅速变为黄色。因此在细菌污染48小时之后，便可用肉眼直接观察。微生物污染后的细胞培养基应该弃去，但如果没有其他替代的培养基可用，则可使用Invivogen的Plasmocin™ Treatment, Normocure™或者 Plasmocure™污染物清除试剂。

当在细胞培养过程中不确定具体是哪种细菌污染细胞时，应该选择哪种抗污染抗生素？

当不确定细胞是被哪种细菌污染时，推荐使用对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有效，具有光谱抗性的Normocure™。目前的研究结果表明，Normocure™可有效预防细胞培养过程中的细菌污染，例如葡萄球菌、无色杆菌。

Ø真菌污染

细胞培养过程中应如何鉴别真菌污染？

由于真菌菌丝可用肉眼或光学显微镜观察，因此真菌污染细胞培养基之后可直接通过肉眼或者光学显微镜进行检测。酵母（30-10 um）是形态结构最小的真菌，在光学显微镜下便可被观察到。另外，真菌的生长繁殖会导致培养基中pH值增加，从而使含酚红的培养基呈粉色。在大量真菌污染物存在的情况下，菌落可能形成霉菌，漂浮在培养基表面。此时应立即丢弃培养基，以防孢子传播。

细胞培养过程中为预防或清除真菌污染，Fungin™可以与青霉素、链霉素（Pen-Strep）同时使用吗？

可以的，Fungin™可以与一般的抗生素如青霉素、链霉素一起使用。

Fungin™可以在麦康凯琼脂培养基（MacConkey Agar）和血平板培养基中使用吗？ 

可以的，Fungin™可以在其他培养基，如麦康凯琼脂培养基（MacConkey Agar）和血平板培养基中使用。

已经使用Fungin™处理了7天，但不确定真菌污染是否已全部被清除，对于这个问题有什么建议吗？

Invivogen建议将培养基分成两份，一份继续使用Fungin™继续处理3-4天，另外一份中加入无Fungin™或青霉素-链霉素的新鲜培养基，之后取1 mL至沙氏葡萄糖琼脂培养基中，将培养皿置于20-25℃ 3-5天。此方法可以帮您确认培养基中的真菌污染物是否已全部被清除。

推荐使用什么浓度的Fungin™处理细胞？

说明书中推荐使用50 ug/mL的Fungin™处理细胞，但Invivogen建议同时做75 ug/mL的平行处理组，以估计去除真菌污染的最佳使用剂量。处理时间应持续5-10天。

Ø支原体污染

如何使用Invivogen的支原体检测试剂盒Plasmo TestTM检测支原体？

PlasmoTest™支原体检测试剂盒是一种基于细胞的比色分析方法，利用Toll样受体II可以识别支原体成分（脂肽）的能力，诱导信号级联反应，导致NF-κB和其他转录因子的激活。在支原体存在的情况下，HEK-Blue™-2细胞表面表达的TLR2会激活这些转录因子，进而诱导分泌sAP（分泌性碱性磷酸酶）报告蛋白，可在16 - 24小时内被HEK-Blue™检测培养基检测到。

Invivogen的支原体检测试剂盒Plasmo TestTM只能检测活的支原体吗？

PlasmoTest™支原体检测试剂盒是通过检测支原体脂蛋白来判断是否有支原体存在的，因此其既可以检测细胞培养基中存在的活的支原体，也可以检测死的支原体。

另外，Invivogen的PlasmoTest™支原体检测试剂盒不仅可以检测支原体的脂蛋白，也可以检测细菌的脂蛋白。但是由于细菌污染可直接通过观察细胞培养基的状态进行鉴定，因此，当PlasmoTest™检测试剂盒结果呈现阳性，且细胞培养基无浑浊、颜色无变化时，可以断定培养基受到了支原体污染。

Invivogen的支原体检测试剂盒Plasmo TestTM与其他支原体检测试剂盒相比，有什么优势吗？

PlasmoTestTM是第一个基于细胞分析原理检测细胞培养基中支原体污染的试剂盒，操作者只需具有基本的细胞培养的知识即可进行操作。试剂盒在过夜孵育之后，一小时之内即可获得检测结果。以往常用的支原体检测方法是PCR，但这种检测方法具有明显的缺陷，例如假阴性结果且能够检测的支原体种类受引物限制，无法对全部支原体进行检测。最重要的是，Plasmo TestTM检测结果呈阳性时，即表明细胞培养基中存在支原体污染物，因此不会出现假阳性结果。

在细胞培养过程中使用哪种试剂来预防支原体污染？使用那种试剂清除已污染的支原体？

● Plasmocin™ prophylactic（支原体预防试剂）是专门用于预防支原体污染的，它含有两种有效的杀菌成分，作用于蛋白质合成和DNA复制。

● Plasmocin™ treatment（支原体清除试剂），可在2 - 3周内快速有效地消除支原体污染。如果2-3周之后使用Plasmocin™支原体清除试剂之后无法有效清除支原体污染，或支原体对Plasmocin™产生了耐药性，可使用● Plasmocure™。Plasmocin™ treatment和Plasmocure™均是由两种不同抗生素混合而成，通过不同的机制发挥作用，可使支原体在2 - 3周内全部清除。

在细胞培养时，可以直接使用Plasmocure™代替Plasmocin™ treatment清除已污染的支原体吗？

Plasmocin™ treatment和 Plasmocure™均是混合抗生素，用于清除已污染支原体。然而，Invivogen推荐只有在支原体对Plasmocin™ treatment产生抗性的情况下才可使用Plasmocure™。

如果支原体对Plasmocure™、Plasmocin™ treatment均已产生抗性，应该怎么办呢？

如果使用Plasmocure™、Plasmocin™ treatment均无法有效清除细胞中的支原体污染物，则表明样本中的支原体污染非常严重。这种情况下好的办法是在下一次传代时尽可能稀释您的细胞，以此来稀释细胞中的支原体污染物。之后使用不同浓度（确保对细胞不会有太大毒性的浓度）的Plasmocure™再次处理细胞2周，例如使用工作浓度为50 ug/mL和100 ug/mL的Plasmocure™处理细胞。处理2周之后，将细胞分成两份，一份使用Plasmocure™继续处理一周，另一份不添加任何抗生素，3天后使用PlasmoTest™支原体检测试剂盒检测污染情况，以避免出现假阴性结果。如果您的细胞仍存在支原体污染，请重复以上步骤。

以上的操作步骤可有效清除90%的支原体污染，若您样本中的支原体污染物未得到有效清除，请及时联系我们。