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如何选择合适的二抗?

发布时间: 2024-02-23  点击次数: 220次

二抗用于多种免疫测定中以检测一抗的存在。这些抗体与酶、生物分子或荧光染料缀合,以允许检测一抗。与一抗不同,二抗针对一抗的物种和同种型而产生,并用于通过在多个位置结合一抗来检测一抗。

要成功选择二抗,您应该考虑以下因素:

确保良好匹配– 宿主物种是产生二抗的动物,应始终与一抗宿主不同。例如,如果您使用在兔中产生的一抗,则需要在兔以外的不同物种(如山羊、驴或小鼠)中产生的抗兔二抗(图 1)。

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图 1:二抗机制。

整个抗体还是片段?– 实际上,真正的问题是“您的一抗是单克隆抗体还是多克隆抗体?" 这两个问题的答案通常取决于应用程序。单克隆一抗含有单一同种型的免疫球蛋白。因此,使用特异性识别该同种型的二抗至关重要。此外,单克隆抗体通常在小鼠、兔和大鼠中培养。因此,如果一抗是小鼠 IgG1,您将需要抗小鼠 IgG 或特异性较低的 F(ab) 片段抗小鼠 IgG。抗体片段很适合免疫组织化学和免疫荧光,因为它们尺寸较小且能够穿透组织。然而,较小的尺寸可能会限制与片段缀合的染料或酶的选择,导致二抗的灵敏度可能低于全抗体选择。

多克隆一抗含有多种免疫球蛋白 G 同种型的混合物。因此,为了最大限度地检测靶标,最好使用可识别所有同种型的二抗。多克隆通常在兔、山羊、绵羊和驴中饲养,并以全抗体形式(重链 + 轻链),因此必须用来自不同物种的 IgG 库对第二宿主物种进行免疫,从而使纯化的第二抗体能够识别所有形式。例如,如果多克隆一抗是山羊 IgG,您将需要抗山羊 IgG (H+L)。然而,完整抗体可能会导致高背景和较低特异性,因为轻链由所有免疫球蛋白共享,这会增加交叉反应性(图2)。

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图 2:免疫测定中完整 IgG 二抗与片段二抗的结合机制。

根据您的应用选择结合物- 这取决于二抗如何检测信号。例如,免疫组织化学、ELISA 和蛋白质印迹应用使用基于生物素标记的比色和化学发光检测来放大信号并提高灵敏度,以及与辣根过氧化物酶 (HRP) 或碱性磷酸酶 (AP) 作用的酶反应。然而,对于免疫标记、荧光显微镜和流式细胞术实验,信号是使用荧光染料(例如 Alexa Fluor)检测的,这些染料直接与抗体缀合以放大信号和灵敏度。

亲和纯化与交叉吸附抗体——此步骤用于增加抗体的特异性,可以区分亲和纯化和交叉吸附。大多数二抗都是通过亲和层析纯化的,从而产生高亲和力抗体。此类抗体通常用于 IHC,因为它们提供最小的非特异性结合,以及用于检测低丰度蛋白质的蛋白质印迹。交叉吸附的二抗通常要经过额外的纯化步骤,以滤除与非目标免疫球蛋白种类结合的成员。此步骤增加了它们的特异性并减少了非特异性背景。这些抗体专为免疫组织化学等特定应用而设计。

总之,二抗的选择取决于当前的应用、靶标丰度所需的灵敏度和纯化水平以及非特异性结合的风险。


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