DNA 旋转酶是一种不一样的拓扑异构酶,因为它是能够催化 DNA 负超螺旋的酶。该过程依赖于 ATP,通过双链 DNA 的切割和重新连接以 2 步进行。
有关该反应的概述,请参阅:McKie , 43 ,e2000286。
典型反应如下:
将 1 U DNA 促旋酶与 0.5 µg 松弛 pBR322 DNA 在 30 µl 反应体系中在 1X 检测缓冲液中于 37°C 下孵育 30 分钟
通过添加 30 µl 氯仿/异戊醇 (24/1) 和 30 µl 终止缓冲液 (STEB:40% 蔗糖、100 mM Tris.HCl (pH 7.5)、100 mM EDTA、0.5 mg/ml 溴酚蓝) 来终止每个反应,然后将其加载到琼脂糖凝胶上。(0.8%-1.0%:w/v)
凝胶可以在 TBE(90 mM Tris.Borate、2 mM EDTA)或 TAE(40 mM Tris.Acetate、2 mM EDTA)中运行,但如果在 TAE 中以最高 90V 运行 2 - 3 小时,超螺旋 pBR322 的分辨率会好得多。
典型凝胶:
所用的 DNA 底物(本例中为松弛的 pBR322)通常由琼脂糖凝胶上的一系列条带组成。这些条带是拓扑异构体(具有不同连接数的 DNA)。
用 DNA 促旋酶处理松弛的 pBR322 可将松弛的拓扑异构体转化为质粒的超螺旋形式,后者在琼脂糖凝胶上迁移速度更快。还可以看到上部条带,这是开环(有缺口)DNA,它存在于松弛的基质中,但与一些松弛的拓扑异构体一起迁移。
如果凝胶槽中存在溴化乙锭或氯喹等污染物,则检测可能会出现问题。这些化学物质是嵌入剂,会影响 DNA 的移动性,导致结果混乱。如果缓冲液中存在嵌入剂,则松弛的拓扑异构体会提高移动性,并大致在与负超螺旋质粒相同的位置运行。根据嵌入剂的量,负超螺旋 DNA 的移动性可能略低于正常水平。
如果检测中存在污染性核酸酶(由于检测缓冲液被污染或细胞表达的不纯级分),切口可能会显著增加,从而导致开环 DNA 的数量增加,并可能产生线性 DNA。这在 OC 和 SC 之间以单一带的形式运行。
之前活性酶的活性丧失可能是由于缓冲液中 ATP 的劣化所致,尽管 5X 检测缓冲液已被开发以尽量减少这种情况。如果发生活性丧失,则在反应中添加额外的 ATP 将克服该问题。
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