如何摆脱qpcr苦恼，得到更好的结果

什么是荧光定量PCR？

指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个
PCR进程，使每一个循环变得“可见"，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(or cDNA)的起始浓度进行定量的方法。

定量PCR原理？

与传统PCR一样,反应在温度模块里循环进行；理论上每经过一个循环目的基因的数量都会增加一倍；每个循环结束后,定量PCR仪器通过不同的滤光片记录荧光信号；在扩增过程中,荧光信号随着PCR产物的增加而增强。

定量PCR体系？

普通的PCR体系；模板,引物,dNTPs，buffer，Taq酶；加入各种类型的荧光染料。

在做Real time PCR时，对于SYBR Green I染料法和Taqman探针法都可以，但是二者有区别。SYBR Green I染料法是利用SYBR Green I结合双链DNA来检测PCR产物，可用于监测任意双链DNA序列的扩增，但是必须考虑非特异性扩增。因成本相对低，是目前较常用的)。但是由于SYBRGreen I可以与所有的双链DNA结合，包括非特异性的双链DNA序列，因此可能会产生假阳性信号。

图1：SYBR染料法原理图

Taqman探针法使用荧光探针检测PCR扩增过程中产生的特异PCR产物：特异性荧光信号的产生，需要探针与目标序列进行特异性的杂交；探针可以标记不同的报告基团，因此可以在一个反应管中进行二条序列扩增完整的探针。5′端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3′端荧光淬灭基团(发生荧光共振能量转移)；退火，探针与模板结合，引物在聚合酶作用下进行延伸反应，遇到探针时发挥3′-5′外切酶活性将探针切碎到反应体系中；报告基团与淬灭基团距离变大，在激发光的作用下发荧光。实验结果重复性好，价格高。

图2：TaqMan探针法原理图

说了这么多，不知道小伙伴们对qPCR的理解是不是清晰多了呢?qPCR作为一种简单便捷的定量技术，应该是小伙伴们常用的技术了。虽然听起来简单但做起来却没有想象的那么简单，事实上，实验室做一个样本检测QPCR需要1~2个小时，这个时候不仅试剂盒重要，检测能力也很重要，希望这篇文章能帮助小伙伴们对QPCR有一个清晰的了解