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不同蛋白浓度测定方法优缺点

发布时间: 2022-03-07  点击次数: 8652次

1.    BCA法测定试剂盒

碱性条件下,蛋白将Cu2+还原为Cu+ Cu+BCA试剂形成紫颜色的络合物,测定其在562nm处的吸收值,并与标准曲线对比,即可计算待测蛋白的浓度。不方便的是这种方法需要提前制作标准曲线。BCA蛋白质测定方法灵敏度高,操作简单,试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳。BCA方法适用于表面活性剂存在下的蛋白质浓度检测,可兼容高达5%SDSTritonX-100Tween等。然而,由于BCA方法依靠铜离子进行显色反应,如果溶液中含有与铜离子反应的螯合剂比如EDTA或者还原性试剂比如DTTβ-巯基乙醇,结果将受到很大程度的影响。同时,BCA方法的检测结果也会受到蛋白质内半胱氨酸,酪氨酸,色氨酸含量的影响。

2.    Bradford

该方法的原理是,带负电的考马斯亮蓝染料与蛋白质中碱性氨基酸相互作用。考马斯亮蓝在溶液中显红色,吸收峰在465nm处,当与蛋白质结合后,其显蓝色,在595nm处有吸收峰。595nm处的吸光值与蛋白质的浓度呈正比。

Bradford法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。样品中巯基乙醇的浓度可高达1M,二硫苏糖醇的浓度可高达5mM。但受略高浓度的去垢剂影响。需确保SDS低于0.1%Triton X-100低于0.1%Tween 20, 60, 80低于0.06%

3.    UV280

这种方法是在280nm波长,直接测试蛋白。选择Warburg 公式,光度计可以直接显示出样品的浓度,或者是选择相应的换算方法,将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单,先测试空白液,然后直接测试蛋白 质。从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法,适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说,速度快,操作简单;但是容易受 到平行物质的干扰,如DNA的干扰;另外敏感度低,要求蛋白的浓度较高。

1)简易经验公式

蛋白质浓度(mg/ml) = [1.45*OD280-0.74*OD260 ] * Dilution factor 

2)精确计算

通过计算OD280/OD260的比值,然后查表得到校正因子F,再通过如下公式计算最终结果:

蛋白质浓度(mg/ml) = F *(1/d) *OD 280 * D

其中d为测定OD值比色杯的厚度

D为溶液的稀释倍数

4.    Lowry

     蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合,形成蛋白质一铜复合物,此复合物使酚试剂的磷钼酸还原,产生蓝色化合         物,在一定条件下,利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。

     5、考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法

考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度,是利用蛋白质―染料结合的原理,定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。

考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式,红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合,在一定蛋白质浓度范围         内,蛋白质和染料结合符合比尔定律(Beer’s law)。此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式,最大光         吸收由465nm变成595nm,通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

蛋白质和染料结合是一个很快的过程,约2min即可反应*,呈现最大光吸收,并可稳定1h,之后,蛋白质―染料复         合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数,使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高,在测定           溶液中含蛋白质5µL/ml时就有0.275光吸收值的变化,比Lowry法灵敏4倍,测定范围为10-100µg蛋白质,微量测定         法测定范围是1-10µg蛋白质。此反应重复性好,精确度高,线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲,         这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠,试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低,但直线弯曲程度很         轻,不影响测定。

此方法干扰物少,研究表明:NaCl,KCl,MgCl2,乙醇,(NH4)2SO4无干扰。强碱缓冲液在测定中有一些颜色         干扰,这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris,乙酸,2―巯基乙醇,蔗糖,甘油,EDTA及微量的去污剂如                Triton X―100,SDS,玻璃去污剂有少量颜色干扰,用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是,大量去污剂的存在对           颜色影响太大而不易消除。