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阳离子脂质体的制备及细胞转染

发布时间: 2023-10-25  点击次数: 206次

设备及材料

  • 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺

  • 阳离子脂质

  • 氯仿

  • 蒸馏水

  • 缓冲

  • 带聚四氟乙烯内衬的玻璃瓶

  • 玻璃注射器

  • 氮气或氩气

  • 真空系统

  • 0.22μm 过滤器(可选)

程序

  1. 将每种脂质成分(例如,DOTAP/DOPE)溶解在氯仿中至方便的工作浓度(1-10mg/mL)。

  2. 使用玻璃注射器将所需量的每种成分等分到玻璃瓶中。有关处理脂质有机溶液的更多信息

  3. 全部混合玻璃瓶中的成分。

  4. 使用氮气或氩气流小心地蒸发氯仿(在充分通风的情况下)。

  5. 将脂质残留物放在真空泵上 10-15 分钟,以除去任何残留的有机溶剂。

  6. 从真空泵中取出小瓶,并立即以最终脂质浓度的两倍悬浮在蒸馏水中。

  7. 将脂质分散体超声处理至澄清(2-5 分钟)。

  8. 添加等体积的缓冲液(例如,308mM NaCl、40mM Hepes、pH7.4),并进一步超声处理 2 分钟。

  9. 溶液可通过 0.22μm 过滤器进行灭菌。

脂质/DNA 混合物的制备

  1. 将阳离子脂质分散体与 DNA(每 10μg 脂质 1μg)混合在合适的容器中。

  2. 将脂质/DNA 混合物孵育 5 分钟。在室温下。

  3. 5 分钟后,混合物即可用于转染细胞。

细胞转染

  1. 用 HEPES 缓冲盐水洗涤细胞单层两次。

  2. 将细胞与脂质/DNA 混合物在 HEPES 缓冲盐水(每 100 mm 培养皿 3 ml 混合物)中于 37°C 孵育 90 分钟。

  3. 孵育期结束后,根据需要更换培养基或补充。

  4. 将细胞培养所需的时间并收获。

笔记

  • DOPE:阳离子脂质的常见摩尔比为3:1和1:1。在某些情况下,全部由阳离子脂质组成的脂质系统已被用于转染细胞。

  • 所引用的缓冲系统旨在用于体外使用,并不表明该系统可能适合体内使用。

参考

  • Leventis, R. 和 Silvius, JR (1990)。生物化学。生物物理学。Acta 1023:124-132。



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