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mRNA制备解决方案

发布时间: 2021-06-04  点击次数: 233次

mRNA疫苗在covid-19疫情出圈后,基于mRNA开发新疗法更加受到关注,包括mRNA传染病疫苗、肿瘤免疫疗法(癌症疫苗)、治疗性蛋白质替代疗法和遗传疾病治疗等。 

基于mRNA技术的covid-19广泛使用。目前,全球范围内已有2种mRNA疫苗获得FDA的EUA(紧急使用授权),分别是由德国BioNTech、辉瑞和复星医药共同研发的BNT162b2(有效率95%)以及美国Moderna公司研发的mRNA-1273(有效率94.1%)。

在国内,由沃森生物、苏州艾博生物、军事科学院军事医学研究院共同研制的mRNA covid-19ARCoV将于5月30日起在墨西哥开始III期试验;斯微生物的mRNA疫苗也进入了I期临床试验。

既然mRNA疫苗这么受欢迎,今天我们就来讲讲mRNA疫苗是如何体外制备的。

mRNA疫苗的制备

covid-19为例,我们首先分离出病毒株,测序及分析获得病毒的完整基因序列,然后通过基因工程技术,利用化学合成的方式,合成S刺突蛋白所对应的病毒RNA片段,为了方便接下来的RNA大量复制,RNA片段首先在DNA聚合酶的作用下,发生逆转录合成双链DNA结构。在基因克隆技术中,通常将要复制的DNA嵌入到载体质粒中,利用细菌快速繁殖,培养,复制出大量嵌入S蛋白DNA质粒的细菌,经过提取,分离,纯化等工艺,得到大量纯净S蛋白DNA。S蛋白DNA通过使用转录试剂完成体外转录得到大量mRNA,mRNA单独存在时结构并不稳定,所以在最终制成疫苗时,需要在mRNA外层包裹一层脂类,最终完成mRNA疫苗的制备。

mRNA的结构及优化策略

1 mRNA加帽

真核细胞mRNA的5'端有一个帽子结构,它是在mRNA转录后,由甲基化的鸟苷酸(m7G)经焦磷酸化与mRNA的5'端核苷酸相连。5'端帽子结构在mRNA许多生物学功能中起到重要的作用,这包括:mRNA的剪切、稳定、转运和核糖体的募集等。由于5'端帽子结构的重要生物学功能,在mRNA疫苗研发过程中需要优化5'端帽子结构,并利用合适的工艺对mRNA原料进行“加帽”。

mRNA疫苗产品的加帽可以在mRNA的体外转录过程中通过掺入“帽子序列”实现,这种加帽技术会将加帽序列反向加在mRNA上,这会导致约1/3的加帽失败。通过掺入特殊的帽子结构——“anti-reverse”帽子结构(ARCA)可以降低这种反向加帽失误的出现。另外,还可以先合成不带帽子结构的mRNA,再利用痘病毒的“加帽复合物”对mRNA进行加帽,这也是一种mRNA的加帽手段。

2.非翻译区序列(UTRs)修饰

在mRNA的编码区两端各存在一段非翻译区(UTRs),在5'端的被称为5'端UTR,在3'端的被称为3'端UTR。

非翻译区序列不是密码子,不能翻译成氨基酸,但是可以通过RNA结合蛋白控制mRNA产品的降解和转录效率。因此,每一种mRNA疫苗都需要考虑如何设计产品的UTR组件,进而提高在目的细胞中mRNA疫苗的稳定性和转录效率。大量的研究发现非洲爪蟾和人源的α-球蛋白/β-球蛋白的UTR序列非常稳定,而且能够增加异源的mRNA的表达效率,因此这两个蛋白的UTR原件通常被设计为mRNA疫苗的UTR组件。当然,也有其它蛋白的UTRs被研究用于mRNA疫苗的组件,在此不再赘述。

3.Poly(A)

大多数真核生物的mRNA 的3'端都有由100~200个腺苷酸聚合形成的Poly(A)尾巴。mRNA的Poly(A)尾巴可以和5'端帽子结构共同合作,增强mRNA结构的稳定性。Poly(A)尾巴首先和大量的Poly(A)结合蛋白(PABP)结合,然后募集真核生物起始因子4G(eIF4G),增加Poly(A)跟5'端帽子结构的亲和力,最终mRNA的Poly(A)尾巴和5'端帽子结构首尾相接,形成环装mRNA。环装mRNA结构有利于核糖体的募集,其特殊的结构也能保护mRNA不被降解。

在mRNA体外合成过程中,Poly(A)尾巴可以通过质粒DNA模板转录获得,也可以先合成mRNA再通过Poly(A)聚合酶加上不同单位数量的尾巴。前者能够在mRNA产品中加入特定数目的Poly(A),而后者加入的单位数不确定。

Poly(A)尾巴的单位数目对于其生物学作用起到了至关重要的作用。在哺乳动物细胞内,活跃表达的mRNA包含的Poly(A)序列的长度为100-250个。有研究发现,表达效率越高的mRNA,其Poly(A)尾巴越短。但是当Poly(A)单位长度小于12时,mRNA结构就不再稳定,容易被降解。在设计mRNA疫苗产品的序列时,Poly(A)的长度也是非常重要的优化指标。

4. 开放阅读框

开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)包涵了mRNA的全部编码序列,负责进入人体后表达mRNA运载的抗原靶蛋白。

密码子水平的修饰,利用常用的密码子,选用tRNA较多的密码子;使各个密码子的比例更接近靶物种或者细胞的比例;

GC含量的修饰,避免复杂二级结构形成;二级结构对mRNA的延伸和转录非常重要,高稳定的二级结构和发夹结构需要避免。这样的二级结构可以阻止核糖体的进入、扫描以及容易被先天性免疫识别为PAMP。

mRNA疫苗制备试剂盒:

Cellscript   T7 mScript™ Standard mRNA Production System  C-MSC11610/C-MSC100625

该试剂盒包含T7 RNA聚合酶,加帽酶,加尾酶,以及2'-O-甲基转移酶, 可以一站式解决mRNA制备过程。

T7-FlashScribe™ Transcription Kit  C-ASF3507  1ug线性化的DNA为模板,在30min内体外转录可以得到180ugRNA。

 

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产品名称

货号

品牌

T7-FlashScribe Transcription Kit

C-ASF3507

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T7-Scribe Standard RNA IVT Kit


C-AS3107

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ScriptCap m7G Capping System

C-SCCE0625

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ScriptCap 2'-O-Methyltransferase Kit

C-SCMT0625

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ScriptCap Cap 1 Capping System

C-SCCS1710

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A-Plus Poly(A) Polymerase Tailing Kit

C-PAP5104H

cellscript

 

北京和一生物作为Cellscript的国内授权代理,为你提供CellScript公司全套的mRNA生产的原料,目前产品主要包括体外转录试剂盒,帽类似物,加帽酶,加尾酶,以及一些修饰核苷等等,北京和一生物为你提供全套mRNA制备的解决方案,助力抗击covid-19,期待你的咨询!

 

 

 

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